Роль процессов метилирования в поддержании здоровья
Метилирование — это одна из наиболее важных метаболических функций организма. Адаптация к стрессу и жизненным перипетиям — это реакции, в которых процессы метилирования играют первостепенное значение. Без адекватных процессов метилирования человек не способен эффективно адаптироваться к изменяющимся условиям, что является прямым путем к преждевременному старению.
Метилирование — это контролируемая передача метильной группы (СН3) от одного вещества другому: белкам, аминокислотам, ферментам и ДНК. Реакции метилирования происходят триллионы раз в каждой клетке в каждую минуту.
Регуляция цикла метилирования
Метилирование регулируется ключевыми ферментами и кофакторами. Кофакторы представлены определенными витаминами и микроэлементами. К ним относятся цинк, магний, B2, B6, фолаты, B12, ниацин и другие. Когда организму не хватает необходимых субстратов или кофакторов, это ставит под угрозу процессы метилирования.
Одной из причин, ведущей к дефициту поступления витаминов и микроэлементов является следование определенной диете. Другой причиной является патология желудочно-кишечного тракта, которая также приводит к неусвоению важных для реакций метилирования компонентов. Третья причина — это наличие генетических полиморфизмов, которые снижают способность поглощать и использовать питательные вещества.
Что такое SNP или генетические полиморфизмы?
Для того, чтобы узнать о «слабых сторонах» здоровья, нет смысла смотреть полные профили генов, можно проверить только определенные области, представляющих интерес.
Генетический полиморфизм — это существование в популяции нескольких альтернативных состояний ДНК двух гомологичных хромосом. Все хромосомы в организме, кроме половых, — парные, поэтому хромосомы из одной пары именуются гомологичными. Последовательность ДНК образована четырьмя нуклеотидными основаниями: A, C, G и T. Если две последовательности ДНК — AAGCCTA и AAGCTTA — отличаются на один нуклеотид, в таком случае говорят о существовании двух аллелей: C и T. Замена одного нуклеотидного основания другим происходит по причине точечных мутаций. Если частота таких замен встречается менее 1% в популяции, речь идет о SNP. Когда SNP встречается в гене, то ген описывается, как имеющий более одного аллеля. В этих случаях SNP могут приводить к изменениям в аминокислотной последовательности и тем самым нарушать структуру продукта гена, менять его свойства. SNP не всегда связаны с генами, они также могут встречаться в некодирующих областях ДНК.
Хотя конкретный SNP может не вызывать расстройства, некоторые SNP связаны с определенными заболеваниями и состояниями. Знание о конкретных изменениях в «правописании» ДНК, позволяет оценить генетическую предрасположенность человека к развитию заболевания.
Как оценить работу цикла метилирования?
Существует генетическое тестирование, которое позволяет оценить работу ключевых ферментов цикла метилирования. Эта панель SNP была разработана доктором Эми Яско. Панель Яско включает SNP для ряда генов, которые являются неотъемлемой частью путей метилирования.
Генетические особенности метилирования
Генетические вариации играют очень важную роль в процессах метилирования. Наличие определенных SNP (однонуклеотидных полиморфизмов) составляют основу несбалансированного метилирования. SNP может присутствовать в одном или обоих генах. Когда он присутствует в одном из генов, то называется гетерозиготным полиморфизмом, когда присутствует в обоих генах — это гомозиготный полиморфизм.
Из-за наличия полиморфизмов в гомо- или гетерозиготном состоянии, снижается активность путей метилирования. В результате ощущается нехватка метильных групп для выполнения ряда важных функций. Это может заложить основу для дальнейшего пагубного влияния факторов окружающей среды, инфекционных агентов, создать предпосылки для серьезных заболеваний.
Активность SNP и экспрессия генов часто могут быть изменены эпигенетическими факторами: диета, образ жизни, питание, воздействие токсических веществ. Эффекты SNP часто кумулятивны; экспрессия одного SNP часто зависит от наличия или отсутствия других SNP.
Идентификация SNPs и их влияние на здоровье и физиологию является постоянной областью исследований — обнаружение и изучение этих небольших изменений в ДНК приведет к улучшению самочувствия и более индивидуализированным медицинским вмешательствам.
Благодаря пониманию, как работают пути метилирования и как связаны генетические полиморфизмы (вариации) с биохимическими путями, можно составить персональную карту восприимчивости к тем или иным заболеваниям. Определив районы «генетической хрупкости», можно дополнить эти пути с помощью нутригенетического питания и таким образом оптимизировать работу биохимических циклов.
Эпигенетика в законе: о чем метилирование ДНК расскажет криминалистам
Что мог бы рассказать эпигенетический анализ о витрувианском человеке да Винчи? Рисунок в полном разрешении.
Автор
Редакторы
Рецензенты
Современный генетический анализ творит чудеса в судебной экспертизе. Однако можно ли добыть еще какую-то информацию из биологических материалов, найденных на месте преступления? Оказывается, можно, и в этом поможет эпигенетика! Не затрагивающее саму последовательность нуклеотидов в ДНК метилирование генов может рассказать множество интересных и важных подробностей о человеке и образе его жизни — а это, безусловно, крайне важная информация для криминалистики.
Криминалистика
Спецпроект посвящен криминалистике — науке, которая занимается расследованием преступлений.
Партнер публикации — компания QIAGEN (Германия), мировой лидер по разработке реагентов и оборудования для проведения фундаментальных и прикладных исследований в области молекулярной биологии. В качестве рецензента выступила ведущий специалист по идентификации личности в «Кайджен Рус» (ранее — сотрудник ведущих лабораторий Министерства внутренних дел и Следственного комитета России), член международной организации судебных генетиков Марина Вячеславовна Барышева.
В качестве рецензента этой статьи выступила Светлана Александровна Боринская — заведующая лабораторией анализа генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, специалист в области исследования генома человека и популяционной генетики.
Спецпроект выполнен в сотрудничестве со Следственным комитетом Российской Федерации. Куратор спецпроекта — старший эксперт отдела медико-биологических исследований судебно-экспертного управления Следственного комитета Российской Федерации Сергей Васильевич Кряжов. Вместе с ним эту статью рецензировали старшие эксперты отдела медико-биологических исследований судебно-экспертного управления Следственного комитета Российской Федерации Марина Игоревна Чухряева и Глеб Дмитриевич Степанов.
Также в качестве рецензента мы пригласили Елену Клещенко — биолога, научного журналиста и писателя, заместителя главного редактора портала PCR.news, автора книги «ДНК и её человек».
Идентификация преступника по уликам, найденным на месте преступления, — один из краеугольных камней криминалистики. Этот принцип был сформулирован еще французом Локаром: каждый контакт оставляет след. Подробнее о том, какие бывают следы и какие придуманы экспертизы, чтобы их идентифицировать и изучать, мы уже писали в предыдущей статье нашего спецпроекта «Криминалистика и судебные экспертизы: запутанная история» [1].
Генетический материал обычно получают из жидкостей организма: крови, слюны, спермы; но могут использоваться и другие биологические ткани и выделения человека: костные останки, зубы, волосяные луковицы и пот, содержащий эпителиальные клетки.
А что, если бы можно было узнать, сколько лет хозяину ДНК, как он выглядит, где живет и какие у него привычки [4], [5]? В этом поможет эпигенетический анализ. Ну а вспомнить (или же узнать впервые), что такое эпигенетика, мы рекомендуем при помощи врезки чуть ниже.
Эпигенетическая экспертиза вошла в криминалистику совсем недавно. Однако количество публикаций, посвященных применению эпигенетики в криминалистике, увеличивается практически с каждым годом, что говорит об актуальности и востребованности данного направления. Сегодня PubMed содержит уже несколько сотен таких публикаций (рис. 1). Речь о том, что потенциально метилирование ДНК могло бы использоваться в криминалистике, зашла и вне научного общества: например, в 2009 году обсуждение этого было включено в популярный сериал Law and order: special victims unit («Закон и порядок: специальный корпус»), в эпизоде Perverted («Извращенный») [6].
Рисунок 1. Рост публикаций в Pubmed по запросу forensic epigenetics. Скриншот сделан в конце мая 2020 года.
Что такое эпигенетика?
Со времен учебы в школе многие помнят, что генетически почти все клетки тождественны друг другу. Правда, за некоторыми исключениями: например, половые клетки содержат вдвое меньший набор хромосом, а эритроциты и вовсе утрачивают ядро вместе с его ДНК. И уже лишь в университете некоторые узнаю́т, что это правило имеет на самом деле больше исключений: так, геном лимфоцитов претерпевает «перетасовки» для синтеза астрономического разнообразия антител и Т-клеточных рецепторов, а так-то вообще и «обычные» соматические клетки из-за мутаций не являются абсолютно точными копиями друг друга: за подробностями отсылаем читателей к статье «Геномная головоломка: открой в себе мозаика» [8].
Аберрации метилирования ДНК, одного из главных «столпов» эпигенетики, играют роль при различных типах рака и нарушениях развития — например, при синдроме ломкой Х-хромосомы, синдромах Прадера—Вилли, Ангельмана и Беквита—Видемана [6].
Как это работает? CpG-островки
Хотя на практике анализ эпигенетических вариаций (например, для оценки возраста или тканевой принадлежности) пока используется не так широко, как анализ ДНК, их изучение может быть очень ценно при расследовании преступлений. По аналогии с ДНК-фингерпринтом — индивидуальным генетическим «отпечатком пальца» — выделяют и эпигенетический фингерпринт, то есть эпигеномные вариации, возникшие у конкретного человека в ответ на воздействия окружающей среды. В отличие от коротких тандемных повторов, практически не меняющихся с течением жизни и идентичных во всех клетках организма, эпигенетический профиль значительно варьирует как от ткани к ткани, так и во времени [12].
Помимо метилирования ДНК, эпигенетика изучает и другие процессы: например, ацетилирование и метилирование гистонов и малые РНК (о них «Биомолекула» писала в других публикациях [13], [14]). Однако криминалистам удобнее использовать именно дифференциальное метилирование ДНК из-за стабильности in vitro и небольшого количества требуемой для анализа ДНК [15].
Рисунок 2. Схема метилирования цитозина
Гиперметилированные CpG-островки, которые находятся в промоторе гена, делают его недоступным для факторов транскрипции и, следовательно, ведут к инактивации гена (рис. 3).
Рисунок 3. Эпигенетическая регуляция активности генов с помощью метилирования: присоединение метильной группы к цитозину останавливает экспрессию гена. Гиперметилирование (Me на рисунке) CpG-островков ведет к конденсации хроматина путем связывания с гетерохроматин-связывающими белками (HP на рисунке) и ДНК-метилтрансферазами (DNMT). Это приводит к прямому подавлению транскрипции. Деметилирование же CpG-островков приводит к запуску транскрипции путем модификации гистонов (например, ацетилированием Ac) в области энхансера/промотора.
Особенности эпигенетического анализа
Улики, обнаруженные на месте преступления, отличаются от образцов, с которыми работают, например, в медицинских лабораториях: качество такого генетического материала зачастую низкое. Более того, арсенал средств, который могут использовать криминалисты, меньше, а результат надо получить довольно быстро: ведь правоохранительные органы должны действовать оперативно, например, для предотвращения террористического акта или для прерывания цепи серийных преступлений [5], [17].
Более того, обнаруженный биологический след может представлять собой смесь клеток разных тканей/биологических жидкостей одного лица. Если для анализа ДНК это не проблема, то для эпигенетики это не так: у разных тканей разный профиль метилирования. Более того, уровни метилирования зависят от многих факторов: пола, условий жизни, поведения матери во время беременности. Это значит, что технология должна это учитывать и хорошо работать для всего многообразия образцов, используемых в судебной практике [5].
Как провести эпигенетический анализ?
Как же проводят сам эпигенетический анализ? Сначала нужно определиться, какие эпигенетические маркеры анализировать, какие CpG-островки отбирать. Иногда исследователи опираются на те данные о метилировании, которые уже есть в литературе. Однако важно проверить, что они работают для разных типов тканей, важных в криминалистике. Основополагающий метод для многих технологий обнаружения метилирования ДНК — бисульфитная конверсия (обработка бисульфитом натрия, то есть кислой натриевой солью сернистой кислоты), позволяющая отличить метилированные цитозины от неметилированных (рис. 4). Обработка сернистой кислотой в два шага превращает неметилированные остатки цитозина в остатки урацила, а метилированные цитозины остаются без изменений.
Рисунок 4а. Общая схема бисульфитной конверсии
Рисунок 4б. Последующее определение метилированных цитозинов. Условные обозначения: OT — исходная верхняя нить; CTOT — нить, дополняющая OT; OB — исходная нижняя нить; CTOB — нить, дополняющая исходную OB.
2005 год изменил подход к генетическим анализам навсегда: в практику были внедрены методы секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS). Выиграл от этого и эпигенетический анализ, поскольку более старые методы определения эпигенетически модифицированных геномных областей можно объединить с NGS. Например, при использовании Illumina Human Methylation 450K Beadchip команда исследователей под руководством Софии Форат (Sophia Forat) идентифицировала 150 потенциальных тканеспецифических маркеров для анализа крови, слюны, спермы, вагинальной жидкости и менструальной крови [18]. Однако использование микроматриц метилирования ДНК требует большого количества высокомолекулярной ДНК, чего в криминалистике обычно не бывает (см. врезку). Другой недостаток: этот метод качественный, а не количественный, и поэтому для целей судебной экспертизы он может оказаться недостаточно точным. Например, с его помощью трудно отличить низкие и высокие уровни метилирования CpG [15]. Отдельно рекомендуем к прочтению материал по методикам секвенирования [19] из нашего цикла статей «12 методов в картинках»!
Есть у метода обработки бисульфитом и подводные камни. На промежуточном этапе деметилирования образуются гидроксиметилированные цитозины, и при бисульфитной конверсии помечаются сразу обе «версии» цитозина. Однако c этим уже умеют бороться добавлением отдельного ферментативного этапа и вычислять количество гидроксиметилированных цитозинов отдельно.
Часто уровень метилирования CpG-сайтов определяют с помощью микрочипов после бисульфитной конверсии; именно этот метод сейчас считают «золотым стандартом». Он позволяет одновременно проанализировать сотни тысяч CpG, и он сравнительно быстр и дешев. Процедура измерения включает определение уровня метилирования CpG-сайтов в конкретных образцах, фильтрацию полученных результатов для исключения технических ошибок и плохо прошедших реакций, а затем уже идет биоинформатическая и статистическая обработка полученных результатов.
Бисульфитная конверсия при помощи наборов EpiTect
Партнер нашего спецпроекта — компания Qiagen — представляет целый ряд практичных решений для анализа метилирования ДНК.
Рисунок 5. Наборы Epitect от QIAGEN:
EpiTect — полностью готовая система наборов для высокоэффективного преобразования неметилированных цитозинов в урацилы всего за 30 минут и исключительная гибкость в выборе исходного материала (рис. 5).
Рисунок 6. Защитный буфер. а — Специальный буфер защищает фрагменты ДНК во время бисульфитной конверсии и облегчает образование одноцепочечной ДНК для полного превращения бисульфита. б — Для контроля полного перемешивания реакционной смеси и уровня рН, необходимого для полной конверсии цитозина, в состав защитного буфера добавлен специальный краситель.
Материал предоставлен партнёром — компанией QIAGEN
Однако можно проводить идентификацию и непрямыми методами, например, обработкой рестриктазами. Подробнее о различных методах секвенирования, используемых в криминалистике, читайте в статье «Криминалистика. Молекулярно-генетическая экспертиза» [3].
Подробнее об этих типах ПЦР читайте в статье из цикла «12 методов» на «Биомолекуле» [20].
ПЦР-амплификация матричной ДНК при помощи Pyromark PCR kit и амплификатора с новаторскими решениями QIAamplifier 96
PyroMark PCR Kit обеспечивает высокоспецифичную амплификацию матричной ДНК для различных приложений: обнаружения мутаций, анализа SNP, анализа метилирования и секвенирования (рис. 7). Преимущества данного набора:
Рисунок 7. Набор PyroMark PCR Kit — это мастер-микс, состоящий из ДНК-полимеразы HotStarTaq и оптимизированного реакционного буфера PyroMark для высокоспецифичной амплификации. Помимо этого в микс входит уникальная добавка Q-Solution, обеспечивающая эффективное усиление «сложных» (например, GC-богатых) шаблонов. PyroMark PCR Kit также поставляется с концентратом CoralLoad, повышающим выход амплифицированной ДНК.
Высокопроизводительный 96-луночный плашечный амплификатор QIAamplifier 96 — это система для всех видов ПЦР с удобным цветным сенсорным экраном и простым в использовании программным обеспечением с интуитивно понятными функциями, которая может использоваться как в различных режимах программирования, так и по имеющимся шаблонам для быстрого запуска (рис. 8). QIAamplifier поддерживает температуру каждого образца с высочайшей точностью. Прибор обладает новейшей системой защиты от коррозии и конденсации, что продлевает его срок службы: блок с образцами герметично закрыт, чтобы предотвратить попадание конденсата на расположенные под ним контакты и на элементы Пельтье.
Рисунок 8. Плашечный амплификатор QIAamplifier 96. Прибор обеспечивает высокую скорость нагрева и охлаждения (до 4 °C/с), а также равномерность температуры: до ±0,20 °C при 55 °C через 15 с. Диапазон температур градиента: 20–99 °C; максимальный градиент: 20 °C по всему блоку с шагом 0,1 °C. Точность температур составляет ±0,1 °C. Нагреваемая крышка термоциклера QIAamplifier 96 оснащена технологией smart lid с температурным диапазоном 30–110 °C.
Материал предоставлен партнёром — компанией QIAGEN
Появление методов одномолекулярного секвенирования (например, с прямой идентификацией 5-метилцитозина), где отпадает необходимость в ПЦР-амплификации, могло бы очень пригодиться в судебной экспертизе. Однако пока что практичных методов такого рода не создано.
Пожалуй, один из самых простых, быстрых и удобных для судебно-генетических лабораторий метод — бисульфитное пиросеквенирование. Он включает бисульфитную конверсию участка ДНК с использованием специфических праймеров для амплификации области гена-мишени и секвенирование ДНК в реальном времени. Пиросеквенирование позволяет проводить детальный анализ метилирования ДНК с высоким разрешением в определенных сайтах CpG. Его можно использовать для анализа даже небольших геномных областей в 50–100 п.н., содержащих несколько соседних CpG-островков. Также для криминалистов важно, что его можно использовать для анализа старых образцов. Вариации этого метода используются и для изучения геномного импринтинга. Однако у пиросеквенирования есть и недостатки: оно работает с небольшим количеством маркеров и недешево [15].
Пиросеквенирование на приборе PyroMark Q48 Autoprep
PyroMark Q48 Autoprep используется для автоматического пиросеквенирования с интегрированной подготовкой шаблона для расширенного анализа метилирования, определения мутации и количественного определения SNP (рис. 9). Новый дизайн и программное обеспечение удваивают его пропускную способность (по сравнению с предшественником PyroMark Q24 Advanced), сохраняя при этом высокую производительность, что делает его идеальным для функциональных исследований, а также для проверки и валидации большого количества образцов из NGS и экспериментов с массивами данных.
Рисунок 9а. PyroMark Q48 Autoprep с понятным интерфейсом программного обеспечения. Преимущества прибора:
Рисунок 9б. PyroMark Q48 Autoprep
Рисунок 9в. Интерфейс программного обеспечения PyroMark Q48 Autoprep
Рисунок 9г. Интерфейс программного обеспечения PyroMark Q48 Autoprep
Материал предоставлен партнёром — компанией QIAGEN
Другой подход — SBE (single-based extension): метод для идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов (SNP), к которым в рамках анализа метилирования относится Ms-SNuPE (methylation-sensitive single-nucleotide primer extension). Он аналогичен другим количественным анализам метилирования, в которых для различения неметилированных и метилированных цитозинов используют обработку геномной ДНК бисульфитом натрия. Этот метод высокопроизводителен, быстро и качественно определяет метилирование и требует небольшого количества ДНК. Однако у его есть и недостаток: он требует использования радиоактивных изотопов [15], [21].
Еще один метод, подходящий для использования в криминалистической практике, — это секвенирование бисульфит-ампликона со штрих-кодом (BBA-seq), упрощенная версия секвенирования следующего поколения с использованием бисульфита. С его помощью можно получить представление об изменениях метилирования ДНК соседних CpG-островков на одних и тех же цепях ДНК. Этот подход более экономичный, менее трудоемкий, высокопроизводительный и очень точный, однако и у него есть свои недостатки, связанные с различиями в эффективности амплификации отдельных фрагментов ДНК, обработанной бисульфитом, а также с неравномерностью процесса фрагментации и лигирования линкеров [15].
В оценке метилирования можно использовать и масс-спектрометрию, как, например, в Agena Bioscience MassARRAY EpiTYPER, высокочувствительной платформе, с помощью которой можно анализировать как одиночные мутации, так и уровень метилирования [15].
Вкупе со многими перечисленными методами, в первую очередь с qPCR, также применяют метилщепящие рестриктазы MSRE (methylation sensitive restriction enzyme). Они, как следует из названия, расщепляют последовательность ДНК по отдельным сайтам метилирования. Этот метод считается довольно простым, экономически выгодным и позволяет работать с небольшим количеством материала. Более того, при его применении не нужно использовать бисульфитную конверсию [22].
О чем (не) расскажут эпигенетические маркеры?
В предыдущей главе мы определились с тем, как именно оценивать уровень метилирования. Давайте теперь подробно разберем, что же именно можно узнать с его помощью. В определении некоторых характеристик найденного на месте преступления биологического образца эпигенетические маркеры могут дать фору обычной ДНК-экспертизе. Давайте разберемся, как же именно дифференциальное метилирование помогает криминалистам (рис. 10).
Рисунок 10. Возможности эпигенетического анализа в криминалистике: о чем могут рассказать уровни метилирования? (подробности в тексте ниже).
Идентификация типа биологического материала
Всегда полезно знать, какого типа клетки, образцы тканей или жидкости организма найдены на месте преступления (для этого можно использовать серологические и цитологические методы). Однако бывают и совсем запутанные случаи, когда в одном образце оказываются клетки разных тканей: например, когда следы спермы смешиваются с большим количеством клеток влагалищного эпителия, а определение наличия сперматозоидов цитологическим способом сложно. Идентификация помогает понять, что же случилось на месте происшествия, а это необходимо для восстановления целостной картины преступления.
Первые «тканеспецифичные» работы о потенциале использования эпигенетических маркеров появились в 2011 году: речь в них шла об анализе спермы [23]. Затем проводились исследования и по другим жидкостям организма. Сейчас исследователи идентифицировали уже более 150 маркеров, специфичных для различных тканей, которые можно использовать для определения типа клеток, найденных на месте преступления (примеры в табл. 1). Например, в одной работе с использованием одноплексного пиросеквенирования удалось провести анализ по некоторым генам в образце спермы 16-летней давности, причем сами сперматозоиды были разрушены! Стоит отметить, что не для всех жидкостей эпигенетическое определение равноценно: например, менструальные выделения более сложны по составу, поскольку содержат разные типы клеток [5], [17].
Интересно, что коммерческие тесты, основанные на эпигенетических маркерах, уже используются (например в Южной Корее) для определения типа биологического образца.
| Биологическая жидкость | Таргетный ген |
|---|---|
| Сперма | DACT1, C12orf12, cg04382920, cg11768416 |
| Кровь | FOXO3, EFS |
| Слюна | SLC12A8, BCAS4 |
| Вагинальные выделения | LOC404266, HOXD9 |
| Менструальная кровь | SLC26A10, LTBP3 |
Возможность различения монозиготных близнецов
Анализ ДНК-объектов, найденных на месте преступления, может помочь многим: сразу найти преступника по базе данных или выйти на него после обнаружения родственников в открытых базах геномов, или даже попробовать сконструировать его примерный фотопортрет! Подробнее о методах ДНК-гено- и фенотипирования и о работе криминалистических баз данных вы можете узнать из предыдущей статьи нашего спецпроекта [3].
Однако есть одна задача, с которой стандартный анализ ДНК справляется с трудом: различение монозиготных близнецов: у идентичных близнецов почти одинаковые последовательности ДНК. Выяснить, кто же из них оставил «генетический след» на месте преступления, генетическими методами крайне сложно. Можно использовать мутационный анализ, но это отнимает много времени и средств: для начала нужно полностью секвенировать геномы обоих близнецов, а потом, если мутация была обнаружена, прицельно искать ее в имеющемся образце. Также для различения монозиготных близнецов можно использовать различия в клетках их иммунных систем — этой темой активно занимаются наши соотечественники [24].
Но в этом вопросе, возможно, лучше положиться на эпигенетическую экспертизу: ведь у монозиготных близнецов разный эпигенетический профиль (рис. 11). Влияние разных факторов окружающей среды, особенности пищевого поведения и вредных привычек приводят к тому, что в итоге уровни метилирования ДНК оказываются разными. Уже были найдены CpG-островки, на которые можно было бы опираться в анализе, но еще нужно и научиться делать поправки на изменчивость эпигенетического профиля в рамках одного организма с течением времени. Так что, для применения этого метода в судебно-экспертной практике всё еще необходимы более подробные исследования [17], [25].
Рисунок 11. Эпигенетический анализ позволяет различить даже монозиготных близнецов с разными привычками. Подробности в тексте.
Идентификация преступника
Выяснение подробностей о личности преступника — одно из главных преимуществ использования эпигенетического профиля, ведь именно так можно сузить круг подозреваемых. Бывают ситуации, когда удалось и найти отпечатки пальцев, и определить STR-профиль преступника, но кого именно искать — всё еще непонятно.
Изучение этого вопроса становится особенно актуальным в свете введения в некоторых штатах США законов, рассматривающих уголовное преследование матерей, чей стиль жизни во время беременности мог навредить плоду (в прессе некоторые из них окрестили the cocaine mom act) [6].
Итак, что мы можем узнать по эпигенетическому профилю — уровням метилирования CpG-островков определенных участков ДНК — и с какой достоверностью?
Возраст преступника
Изменения в паттернах метилирования ДНК с течением времени наблюдается с первых месяцев жизни человека и других позвоночных, и их даже окрестили «эпигенетическими часами» (рис. 12). Помимо использования для примерной оценки возраста искомого преступника, эта технология могла бы помочь и для проверки возраста людей, доступа к документам которых нет, например, для установления, достиг ли человек, оказавшийся без паспорта, совершеннолетия (как в истории, рассказанной ниже).
Рисунок 12. Эпигенетические часы и факторы, которые влияют на их «ход»
История из жизни
Пять лет назад Европу захлестнул миграционный кризис. Поток беженцев увеличился настолько, что перед многими государствами остро встала проблема предоставления убежищ мигрантам. В этом случае закон предоставляет лучшие условия несовершеннолетним: шансов получить убежище и помощь у них больше, а также есть возможность перевезти и своих родственников в новую страну проживания. При условии ограниченных ресурсов это самая верная стратегия приоритизировать нужды самой уязвимой группы. Однако некоторые «играют» на этом: например, в Хильдесхайме (Германия) один из просителей убежища утверждал, что ему не исполнилось 18 лет, но местные власти никак не могли в это поверить — беженец однозначно выглядел старше. В отсутствии документов доказать реальный возраст очень сложно — для этого можно сделать примерную прикидку по развитию зубов или костей. Однако полиция решила выбрать более продвинутый метод и провести тестирование «эпигенетических часов» мигранта [26]. Для этого она обратилась за помощью к калифорнийской компании Zymo Research. Результат подтвердил подозрения властей: возраст мигранта оценили в 26–29 лет; однако насколько этому тестированию можно доверять?
В зависимости от количества исследуемых островков CpG модели оценки возраста по уровню метилирования делят на общегеномные и геноспецифичные. Первая публикация о более-менее точной оценке возраста по эпигенетическим часам появилась в 2013 году: ее автором стал Стив Хорват (Steve Horvath) из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе [26]. Сейчас модели прогнозирования возраста по малому количеству CpG в основном созданы для следов крови, но таковые существуют и для слюны, спермы и зубов (некоторые гены указаны в табл. 2).
Такие модели позволяют прогнозировать возраст с погрешностью не более 5 лет (разброс до 8–9 лет; для некоторых моделей меньше: например, для PyroMark от QIAGEN его оценивают в 2,5–3 года) — не очень высокая точность, но достаточная для грубых прикидок. Например, модель, созданная командой под руководством Грегори Хэннама (Gregory Hannum), использует 71 маркер (средняя ошибка — 3,9 года) [28], а модель Каролы Вайднер (Carola Ingrid Weidner) и коллег прибегает к анализу всего трех CpG в генах ITGA2B, ASPA и PDE4C со средним абсолютным отклонением от хронологического возраста в 5,4 лет [28]. Вышеупомянутый Хорват также продолжает свои исследования: на образцах буккальных клеток средняя ошибка составила всего 1 год [29].
Рубрика «Комментарий эксперта»
Рассказывает Марина Барышева, ведущий специалист по идентификации личности в «Кайджен Рус», член международной организации судебных генетиков, ранее — сотрудник ведущих лабораторий Министерства внутренних дел и Следственного комитета России.
В прошлом году в одном из регионов России участились случаи хищения денег из банкоматов. Неизвестный «закачивал» в банкомат взрывчатый газ, поджигал его, после этого вытаскивал деньги из банкомата и скрывался в неизвестном направлении. В одном из таких случаев преступник поранился, и криминалисты нашли на месте происшествия следы его крови.
Криминалисты провели ДНК-экспертизу и узнали генетический профиль преступника и его этническую принадлежность. Но в базе данных геномной информации совпадений не обнаружили. Что же делать? Как найти того, кто совершал преступление? С помощью оборудования и реагентов QIAGEN по уровню метилирования эксперты определили, что преступнику 27 лет. Следователям хватило этой информации, чтобы предположить, кто это мог бы сделать. В итоге достаточно быстро преступник был найден. Ему действительно, на тот момент было 27 лет.
Однако погрешность может вырасти: например, для очень пожилых и людей с определенными заболеваниями. Также стоит отметить, что метилом «стареет» с разной скоростью в разных тканях, и сегодня мы не умеем достоверно оценивать возраст для всех них [6], [30], [31].
Более того, есть исследования, утверждающие, что регулярные медитации в течение долгого периода времени, возможно, замедляют ход эпигенетических часов [32]. Как тебе такое, Илон Маск?
Образ жизни
Давно показано, что факторы окружающей среды и некоторые особенности стиля жизни оказываются связаны с метилированием ДНК. Давайте посмотрим, какие же характеристики или особенности человека можно вычислить эпигенетической экспертизой.
Место жительства
К сожалению, как бы ни хотелось, пока с помощью эпигенетических изменений нельзя определить место жительства — а если и можно, то пока только на уровне континента. В современном мобильном мире нельзя точно сказать, где человек проживает, просто определив его происхождение (на «Биомолекуле», кстати, опубликован целый проект о генетической генеалогии). Возможно, в будущем будет изучено, как на уровне области проживания уровень метилирования коррелирует с воздействием ультрафиолетового излучения и наличием различных патогенов. Также на метилирование может влиять уровень загрязнения воздуха и присутствие различных опасных для здоровья соединений — например, тяжелых металлов.
Социоэкономический статус
Социоэкономическое положение человека — очень сложный фактор, состоящий из множества компонентов: образование, профессия, доход, семейное положение и другие. Можно предположить, что уровни метилирования будут различаться при разных уровнях стресса или воспаления. Есть данные, что у людей, занимающихся физическим трудом, в целом наблюдается снижение метилирования на 24%. Кроме того, эпигенетическое перепрограммирование циркадных генов отмечено и при перемещении по разным часовым поясам [5], [6], [33].
| Фактор | Таргетный ген с CpG-островками |
|---|---|
| Возраст | ELOVL2, C1orf132, TRIM59, FHL2, ASPA, SCGN, CSNK1, ITGA2B, PDE4C, KLF14 |
| Курение | F2RL3, AHRR, ALPP2, GFI1, GPR15, MYO1G |
| Уровень физической активности | L3MBTL1, TCF7L2, KCNQ1 |
| ИМТ | PM20D1, MMP9, PRKG1, RFC5 |
| Уровень стресса | AVP, FKBP5, OXTR |
| Воспаление | CCL1, CD1D, NFATC1 |
| Признак | Предсказание по метилированию (%) | Предсказание по генам (%) | Суммарный балл (%) |
|---|---|---|---|
| Индекс массы тела (кг/м 2 ) | 12,5 | 10,1 | 19,7 |
| Потребление алкоголя (единиц в неделю) | 12,5 | 0,7 | 13,0 |
| Статус курения (курит / курил ранее / некурящий) | 60,9 | 2,8 | 61,4 |
| Уровень образования (годы) | 2,5 | 4,0 | 5,9 |
| Общий холестерин (ммоль/л) | 2,7 | 1,1 | 3,6 |
| ЛПВП холестерин (ммоль/л) | 15,6 | 1,9 | 17,3 |
| ЛПНП холестерин (ммоль/л) | 0,6 | 1,8 | 2,4 |
Этический вопрос
Если по малому количеству метилированной ДНК можно сказать об образе жизни, то насколько конфиденциальны эти данные в современном мире? Не будет ли это, например, дискриминировать индивидуума перед работодателем, при оказании услуг медицинской помощи или при оформлении медицинской страховки? Или, например, не будут ли осуждаться обществом люди, которые стареют быстрее других по «эпигенетическим часам» в духе «сами виноваты, не позаботились о себе»? Как и применение ДНК-экспертизы, изучение профилей метилирования порождает этические и социальные проблемы, и это непременно должно найти отражение в регулировании использования подобных методов [5], [31].
Одна из самых главных международных инициатив, где, среди прочего, рассматриваются и эти вопросы, — программа исследований и инноваций Horizon 2020 Европейского Союза VISAGE (VISible Attributes through GEnomics), которую поддерживают различные организации таких стран, как Голландия, Франция, Польша, Швеция, Испания, Германия, Австрия и Великобритания. Как указано на их сайте, глобальная цель VISAGE — как можно быстрее расширить применение ДНК в судебной экспертизе для создания примерных описаний неизвестных преступников, используя максимальное количество биологических улик (в рамках существующих правовых и этических норм). В частности, собрать уже существующие и найти новые маркеры ДНК, которые могут дать наиболее подробные данные о внешности, возрасте и происхождении индивидуума; разработать и проверить в рамках криминалистической экспертизы инструменты на основе секвенирования нового поколения для одновременного анализа идентифицированных ранее маркеров, а также создать программное обеспечение для этих нужд. Особо отмечено, что нужен тщательный анализ юридической и этической сторон проблемы.
Эпигенетика в криминалистике сегодня и завтра
Хотя сейчас анализ дифференциального метилирования еще применяется не так широко, как другие методы криминалистики (и неизвестно, насколько «соврал» анализ эпигенетических часов беженца в Германию), уже ясно, что эпигенетические методы прекрасно дополняют общепринятые в судебной экспертизе генетические подходы. Так, разработка стандартного набора маркеров для определения возраста стала бы логичным расширением уже используемого во всем мире ДНК-анализа. Количество исследований по этой теме растет, некоторые идеи уже предлагают воплощать на практике.
Рубрика «Комментарий эксперта»
Рассказывает Светлана Александровна Боринская, заведующая лабораторией анализа генома Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Использование эпигенетических маркеров для определения возраста активно обсуждается не только на Западе, но и в России и Беларуси. К 2021 году Союзное государство в рамках идущей научно-технической программы планирует разработать методику для определения возраста индивидуумов из как минимум четырех этногеографических групп населения РФ [35].
Научно-технические программы Союзного государства формируются для решения важных для государств-участников проблем. Разработка методов ДНК-идентификации и получения информации о неизвестном индивиде по его ДНК, безусловно, представляет интерес для криминалистов обеих стран. Одной из таких характеристик является возраст, который можно оценить по уровню метилирования ДНК. На метиломный возраст влияет множество факторов, поэтому необходимо проверить на российских и белорусских популяциях, как работают уже известные методики определения возраста по уровню метилирования ДНК, нужно ли вводить поправочные коэффициенты, связанные с антропометрическими особенностями или образом жизни.
Так, в частности, индекс массы тела может влиять на результат определения возраста по метилированию цитозинов в избранных CpG-сайтах, а среднее значение индекса заметно варьирует в популяциях, представляющих разные этнические группы (например, у русских и татар в среднем он выше, чем у удмуртов ). То же относится и к потреблению алкоголя и курению — степень их влияния необходимо оценить.
Есть данные, что имеются расовые/этнические различия по уровням метилирования [36]. Например, для этнических групп такие характеристики как жизненный стиль и потребление алкоголя могут различаться, и следовательно, возраст по уровню метилирования тоже будет определяться по-разному. Теоретически оказывать воздействие может даже широта проживания или тип почвы. Но пока это всё исследовано недостаточно, именно поэтому в нашей программе исследуется данный вопрос.
В целом, разрабатываемые методики основаны на известных принципах, но учитывают характеристики различных групп населения Союзного государства. Хотя в разработке методик мы используем различные варианты секвенирования и чипов, позволяющие проводить широкогеномные исследования, параллельно идет разработка методик с использованием метилщепящих рестриктаз. Если давно используемые рестриктазы оставляют нетронутыми сайты, в которых участок их распознавания метилирован, метилщепящие рестриктазы как раз такие сайты и разрезают. Анализ ДНК с применением рестриктаз — рутинная методика, не требующая дорогого оборудования, и при определении метилирования лишь небольшого числа сайтов может оказаться выгодным.
Однако если какой-либо этноспецифичный фактор меняет оценку возраста на 3–4 месяца, а ошибка метода составляет 3–4 года, то фактор добавит неточности незначительно. Значит, такой метод можно использовать.
Однако есть и не до конца решенные концептуальные и технические вопросы. Так, одни методы (например, использующие микроматрицы или секвенирование целого генома с обработкой бисульфитом) требуют большого количества высококачественной ДНК. Другие технологии (пригодные для анализа ДНК плохого качества или её небольших количеств — например, пиросеквенирование и EpiTYPER) работают с малым количеством маркеров.
К тому же, пока рутинное использование секвенирования следующего поколения в криминалистической практике слишком дорого для государств. Где же выход?
Без сомнения, технологии будут развиваться и адаптироваться под нужды криминальной экспертизы. Возможно, будут усовершенствованы не только методы анализа материала, но и способы извлечения ДНК из образца [15]. Вероятно, произойдет и удешевление использования методов, как это случилось с другими подобными технологиями [12], [37]. Есть надежда на разработку методов, позволяющих одновременно проводить генотипирование и эпигенетический анализ.
Когда оценка метилирования войдет в широкую практику, она потребует решения этических и юридических вопросов, общих для применения генетического анализа в судебной экспертизе. Когда все технологии будут отработаны и готовы к широкому применению, понадобится стандартизация протоколов и методов как внутри стран, так и на международном уровне [39]. Что же, кажется, пора ждать наступления золотой эпохи эпигенетики в криминалистике?
