аденовирусная днк что это такое
Аденовирус, ДНК Adenovirus spp в крови
Описание
Аденовирус, ДНК Adenovirus spp. в крови, качественный — определение ДНК Adenovirus spp в крови, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».
Метод ПЦР позволяет идентифицировать в биологическом материале искомый участок генетического материала и обнаружить единичные молекулы ДНК вируса, не выявляемые другими методами. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий, специфичных для данного возбудителя участка ДНК.
С помощью ПЦР-анализа можно диагностировать инфекцию в остром периоде и выявлять случаи носительства.
Аденовирусы — семейство ДНК-содержащих вирусов, принадлежащих к группе вирусов, оказывающих повреждающее действие на мембраны клеток и оболочки тканей. Их около 40 серологических вариантов. Роль аденовирусов в патологии человека неодинакова.
Аденовирусы относительно устойчивы во внешней среде, выдерживают температуру до 50°С и сохраняются при замораживании. Аденовирусы хорошо размножаются на культуре ткани человека и животных.
Аденовирусная инфекция — группа антропонозных, острых вирусных заболеваний с поражением слизистых дыхательных путей, глаз, кишечника, лимфатических узлов и протекающая с умеренно выраженной интоксикацией.
Возбудители аденовирусной инфекции — ДНК-содержащие вирусы рода Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Инкубационный период обычно 4–6 дней. Основной путь передачи — воздушно-капельный. Так как вирус размножается и в слизистой оболочке кишечника, то возможен и алиментарный путь передачи.
Аденовирусными инфекциями в основном болеют дети до 14 лет. Аденовирусы преимущественно поражают дыхательную систему, глаза, кишечник, лимфатические узлы, печень, селезёнку. В основном аденовирусная инфекция протекает как ОРВИ, но возможны более тяжёлые варианты течения — пневмонии. При инфицировании роговицы — возможны тяжёлые варианты течения с потерей зрения.
Клинические проявления аденовирусной инфекции
Клинические проявления аденовирусной инфекции: фарингит, пневмонии, кератоконьюнктивит, конъюнктивит, ринит, ринофаринготонзиллит, бронхит, ринофарингит, ринофарингобронхит, ларинготрахеобронхит, диарея, неспецифический мезаденит (генерализованная форма). Температура при аденовирусной инфекции колеблется в пределах 38–39 °С. Явления токсикоза выражены слабо или умеренно. Симптоматология зависит от распространённости процесса.
Забор крови производится в соответствующую пробирку строго до метки.
Сразу после заполнения и извлечения пробирки из держателя её нужно аккуратно перевернуть 5–10 раз на 180° для смешивания пробы с наполнителем. Не встряхивать!
Интерпретация результатов
Ответ выдаётся в качественном формате: «обнаружено» или «не обнаружено».
Показания
Показания
Кровь необходимо сдавать утром с 08.00-12.00, спустя 2-4 часа после последнего приема пищи. Накануне сдачи исследования нужно исключить физические и психоэмоциональные нагрузки.
Интерпретация результатов
Ответ выдается в качественном формате: «обнаружено» или «не обнаружено».
Аденовирусная днк что это такое
Исследование для выявления серотипов 40 и 41 аденовируса, в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (ДНК) вируса в кале.
Аденовирус, серотипы F40/F41 [Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени].
Group F adenovirus, AdV, HAd V [Real-Time Polymerase Chain Reaction, quantitative, RT-PCR, qPCR, qRT-PCR.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Общая информация об исследовании
Аденовирус – это безоболочечный ДНКсодержащий вирус, принадлежащий к семейству Adenoviridae. В зависимости от таких характеристик, как структура гемагглютинина, длина гена фибера и количество GC-пар в геноме, различают 68 серотипов аденовируса, объединенных в 7 групп (7 видов): A-G.
Аденовирус является возбудителем широкого спектра заболеваний человека, включая ОРВИ, конъюнктивит, геморрагический цистит и гастроэнтерит. Аденовирус – причина 4-12 % случаев вирусного гастроэнтерита. Это второе место по частоте (первое место – ротавирус). Наиболее часто аденовирусная кишечная инфекция наблюдается у детей в возрасте до 2 лет, однако также могут болеть подростки и взрослые люди. Хотя чаще заболевание имеет благоприятный прогноз, аденовирусная инфекция может принять тяжелое течение, особенно у людей с пониженным иммунитетом (состояние после трансплантации аутологичных стволовых клеток, СПИД). Разные серотипы ассоциированы с разными клиническими признаками инфекции. Так, например, серотипы C1 и B7 часто обнаруживаются при ОРВИ, тогда как серотипы F40 и F41 – при гастроэнтерите (кишечные типы вируса). Более того, показано, что разные серотипы аденовируса могут по-разному отвечать на противовирусные препараты. Учитывая эти особенности, крайне желательно идентифицировать видовую принадлежность аденовируса и его серотип.
Для диагностики аденовирусной инфекции могут быть использованы следующие методы:
РТ-ПЦР – метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в кале) фрагменты генетического материала ДНК аденовируса. РТ-ПЦР обладает несколькими преимуществами по сравнению с другими методами диагностики аденовирусной инфекции:
Следует отметить некоторые ограничения метода РТ-ПЦР:
Результат исследования оценивается с учетом анамнестических, клинических и других лабораторных данных.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Референсные значения: не обнаружено.
Что может влиять на результат?
Кто назначает исследование?
Терапевт, педиатр, врач общей практики, инфекционист, эпидемиолог.
Что такое аденовирус
Что если вам скажут, будто одна и та же группа вирусов может вызывать все на свете заболевания, – от банальной простуды до инфекций мочевого пузыря? Несколько странно, не так ли? И определенно это не та новость, которую хотелось бы услышать в преддверии гриппозно-простудного сезона (за что просим прощения).
Однако это соответствует действительности: представители группы патогенов, называемых аденовирусами, в некоторых случаях могут быть смертельно опасны. Корреспондент сайта « Health » обратился к эксперту в области инфекционных болезней за разъяснениями вопросов о том, что в сущности представляют собой аденовирусы, какие симптомы они могут вызывать и как можно вылечиться.
И вот что необходимо знать.
Согласно информационным материалам Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), аденовирусами называют группу обычных вирусов, способных вызывать широкий спектр заболеваний, включая обычную простуду, желудочный грипп, ангину, бронхит, диарею, эпидемический конъюнктивит, лихорадку, – словом, все заболевания, протекающие с умеренно выраженной симптоматикой и, как правило, поддающиеся лечению в домашних условиях. Однако некоторые штаммы аденовирусов приводят к более серьезным проблемам, например, к инфекциям мочевых путей или воспалению легких.
Поскольку аденовирусы чрезвычайно разнообразны, вызываемая ими симптоматика также варьирует очень широко. В основном, развиваются респираторные заболевания и конъюнктивиты. Это означает, что именно аденовирусы «виновны» в большинстве регистрируемых случаев кашля, хрипов и зудящих красных глаз.
Отличие аденовирусов от прочих вирусов (например, от вируса гриппа) заключается в том, что первые не обязательно предпочитают холодное время года. «Аденовирусные инфекции наблюдаются круглогодично, – говорит Фрэнк Эспер, доктор медицины, педиатр, специализирующийся на инфекционных болезнях в Кливлендской клинике. – Лето нравится аденовирусу не меньше, чем зима».
Наиболее типичный путь распространения аденовирусной инфекции – через прямой контакт, например, прикосновение, кашель, чихание, рукопожатие, или же через прикосновение к зараженной поверхности с последующим касанием собственного рта, носа, глаз. Реже аденовирусы распространяются через инфицированный кал (при смене подгузника больному ребенку, например) или через воду (в общественных бассейнах и т.п.).
«Могут ли аденовирусы представлять опасность для жизни? – В некоторых случаях, да. Восемнадцатилетняя студентка колледжа при Университете Мэриленда умерла от аденовирусной инфекции во время эпидемической вспышки 2018 года, когда заболело 40 студентов и 15 из них пришлось госпитализировать».
«Как правило, – продолжает доктор Эспер, – под угрозой оказываются лица с ослабленной иммунной системой. Если у вас практически нет иммунитета, тогда аденовирус становится действительно серьезной проблемой».
Именно это случилось с погибшей девушкой, которая, как сообщает « Washington Post «, страдала и боролась с болезнью Крона, – разновидностью хронического кишечного воспаления, – постоянно принимая поддерживающие препараты в связи с данным заболеванием (определенные группы медикаментов, – используемые, в частности, для контроля болезни Крона и лечения рака, – в индивидуальных случаях могут стать причиной иммунодефицитного состояния).
Впрочем, аденовирусы могут становиться опасными даже для лиц с нормально функционирующей иммунной системой. Случится это или нет, зависит от конкретных осложнений аденовирусной инфекции. «Скажем, вирусный миокардит, т.е. воспаление сердечной мышцы, – объясняет доктор Эспер, – может развиться и у иммунокомпетентного человека, и это осложнение может стать фатальным».
«Существует ли лечение от аденовирусов? – Нет, специфическая терапия аденовирусных инфекций пока не разработана, и применяемые в этих случаях безрецептурные лекарства служат лишь для облегчения симптоматики (т.е. для устранения болей или лихорадки, снижения температуры и т.д.)».
В связи с этим приходится повторять, что лучшим средством против аденовирусных инфекций является их профилактика. Это означает частую и тщательную гигиену рук, исключение случаев употребления пищи или напитков из общей с контагиозным человеком посуды, и избегание любых людей, кто открыто кашляет или чихает (возможно, стоило бы им напомнить: хотя бы используйте локоть, пожалуйста).
В экстремальных случаях применяется препарат под названием цидофовир, но, опять же, его назначают крайне редко. По словам Ф.Эспера, «препарат очень токсичен, он сам по себе может стать причиной тяжелого состояния, например, почечной недостаточности. Обычно мы воздерживаемся от этиотропного лечения аденовирусов и прибегаем к выжидательной тактике. Больной должен быть в очень тяжелом состоянии, чтобы пришлось назначать эти медикаменты».
В общем и целом, для здорового человека аденовирусы не должны составлять особую проблему, – тем не менее, будет разумным соблюдать все меры предосторожности и, если вы все же заболели, защитить близких людей с помощью санитарно-гигиенического режима.
Аденовирусная днк что это такое
Исследование, в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции определяется генетический материал (ДНК) аденовируса в биоматериале. Направлено на диагностику различных клинических форм аденовирусной инфекции.
Аденовирус, аденовирусная инфекция.
Adenovirus, DNA [Polymerase chain reaction, PCR].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Амниотическую жидкость, мазок из зева (ротоглотки), мазок из носа, мазок из носоглотки, отделяемое конъюнктивы, слюну.
Общая информация об исследовании
Аденовирус (Adenovirus) – это ДНКсодержащий безоболочечный вирус. Он является возбудителем различных клинических форм аденовирусной инфекции, в том числе острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), ринофарингита, кератоконъюнктивита, фарингоконъюнктивальной лихорадки, а также более тяжелых состояний (пневмонии и энцефалита). Заболеваемость аденовирусной инфекцией выше среди детей, однако эпизодические случаи и эпидемии также наблюдаются среди взрослого населения. Тяжелые формы аденовирусной инфекции характерны для пациентов с иммуносупрессией.
Аденовирус имеет определенное сходство с другими вирусными и бактериальными инфекциями, протекающими с поражением респираторного тракта (Enterovirus, Epstein-Barr, Herpes Simplex, Cytomegalovirus, пиогенный стрептококк и др.), что значительно затрудняет дифференцирование этих заболеваний на основании клинических признаков, поэтому в диагностике аденовирусной инфекции ведущая роль принадлежит лабораторным методам исследования. В последнее время наибольшее предпочтение отдается полимеразной цепной реакции – ПЦР – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале фрагменты генетического материала возбудителя инфекции. Это один из лучших способов точно и быстро диагностировать аденовирусную инфекцию.
Идентификация аденовируса должна быть осуществлена в кратчайшие сроки, что связано с высокой заразностью инфекции. Кроме того, эффективность противовирусных препаратов максимальна при их назначении в первые 48 часов от начала заболевания, что также диктует необходимость скорейшей постановки окончательного диагноза. По этой причине высокочувствительный метод выявления аденовируса в культуре клеток не может быть использован для быстрой диагностики заболевания (получение результатов занимает 3-4 недели). Исследование с помощью ПЦР, а также экспресс-тест для определения антигена и иммунофлюоресцентный анализ относятся к так называемым быстрым диагностическим тестам, потому что позволяют получить результат в гораздо более короткие сроки. ПЦР занимает особое место среди таких «быстрых» тестов, так как отличается очень высокой чувствительностью (99 %), сопоставимой с чувствительностью метода культивирования вируса.
На основании структурных и антигенных различий все аденовирусы разделены на 52 серотипа. Такое разнообразие приводит к тому, что результаты некоторых анализов на антигены аденовируса (ИФА, РИФ) нередко могут быть ложноотрицательными. В отличие от других методов идентификации аденовируса, исследование с помощью ПЦР основано на выявлении консервативного и характерного для всех серотипов аденовируса фрагмента ДНК (фрагмента hexongene), что обуславливает чрезвычайно высокую чувствительность анализа. При этом в отличие от других тестов чувствительность ПЦР практически не изменяется при взятии материала на фоне начатой терапии противовирусными препаратами. С другой стороны, исследование с помощью ПЦР не предназначено для дифференциальной диагностики различных серотипов вируса.
Выявление специфической для аденовируса последовательности ДНК также обуславливает высокую специфичность теста (98 %). Следует, однако, отметить, что положительный результат исследования не всегда указывает на наличие «живого» вируса (репликации) и не всегда означает, что пациент остается заразным для окружающих. Фрагменты ДНК аденовируса могут быть обнаружены в отделяемом носоглотки в течение длительного времени после эпизода аденовирусной инфекции. Эту особенность следует учитывать при обследовании часто болеющего пациента, чаще всего ребенка. Так, например, выявление Adenovirus с помощью ПЦР у пациента с недавно перенесенной аденовирусной инфекцией и с признаками ОРВИ может свидетельствовать о новом эпизоде заражения аденовирусом этого же или другого серотипа или о бессимптомном носительстве, протекающем на фоне острой инфекции каким-либо другим вирусом. По этой причине исследование на Adenovirus дополняют некоторыми другими лабораторными анализами, включающими тесты на наиболее распространенных возбудителей ОРВИ. Кроме того, необходимо исключение бактериальной суперинфекции.
Adenovirus также может быть обнаружен в мазках из зева 0,6-3 % здоровых детей. Интерпретировать результат исследования следует с учетом дополнительных анамнестических, клинических и лабораторных данных.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Референсные значения: отрицательно.
Причины положительного результата:
Причины отрицательного результата:
Кто назначает исследование?
Инфекционист, педиатр, оториноларинголог, врач общей практики.
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Авторы
Редакторы
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Введение
Эта история началась в середине 1960-х, когда в препаратах аденовируса обезьян случайно было обнаружено загрязнение из маленьких неизвестных частиц [1]. Эти частицы были впоследствии названы аденоассоциированным вирусом (сокращенно ААВ, англ. adeno-associated virus, AAV). Тогда мало кто мог предположить, что именно эти крошечные вирусы дадут надежду многим неизлечимым больным. И лишь несколько исследовательских групп, движимых чисто научным любопытством, отправились изучать базовую биологию ААВ.
Прошло несколько десятков лет, и стало понятно, что ААВ обладает множеством уникальных свойств. Эти особенности позволяют использовать его в поистине революционном направлении — генной терапии. По разным оценкам, около 5% новорожденных детей страдает от различных генетических заболеваний [2]. Долгие годы такие болезни считались неизлечимыми, и для многих подобный диагноз приравнивался к приговору. К счастью, времена изменились. Мы находимся на пороге эры лекарств принципиально нового типа [3], и немаловажную роль в этом сыграл аденоассоциированный вирус [4].
Биология вируса
Какими же уникальными особенностями обладает ААВ? Чтобы ответить на этот вопрос, нужно подробнее поговорить про его жизненный цикл и строение.
Аденоассоциированный вирус принадлежит к роду Dependoparvovirus семейства Parvoviridae. Название рода отражает его необычный жизненный цикл, когда для размножения необходимо наличие вспомогательного вируса (от лат. Dependo — «зависеть»). В качестве такого вируса-помощника, как правило, выступает аденовирус (что явно следует из названия) или представители семейства герпесвирусов [5].
ААВ настолько безобиден, что помимо неспособности самостоятельно размножаться, он не вызывает никаких заболеваний человека и животных. Более того, согласно некоторым исследованиям, большинство людей (>70%) в течение жизни были заражены одним или несколькими серотипами ААВ [6]. (Серотип — вариант вируса, который отличается от других антигенами на своей белковой оболочке).
Вирус довольно мал — его икосаэдрическая белковая оболочка (капсид) в диаметре составляет всего около 25 нм (риc. 1а). Капсид необычайно стабилен: устойчив к кратковременному воздействию тепла, кислой среде и протеазам [7]. Геном, представленный одноцепочечной ДНК, по размерам также весьма скромен — всего 4,7 тысяч нуклеотидов [7].
Этот небольшой геном содержит минимальное количество генов. Ген rep (от слова replication) кодирует белки, необходимые для размножения вируса и его дальнейшей сборки внутри клетки (рис. 1б). Ген cap (от слова capsid) кодирует белки капсида (рис. 1б).
Геном ААВ обрамлен двумя Т-образными шпильками — инвертированными концевыми повторами (inverted terminal repeats, ITR) (рис. 1б).
Рисунок 1. Аденоассоциированный вирус. а — Модель капсида ААВ. б — Геном аденоассоциированного вируса. ITR (inverted terminal repeats) — инвертированные концевые повторы, образующие Т-образные шпильки; rep — ген, кодирующий белки, отвечающие за репликацию; cap — ген, кодирующий белки капсида.
Судьба вируса в клетке
Ценное свойство ААВ — его способность проникать как в делящиеся, так и неделящиеся клетки [8]. На первом этапе аденоассоциированный вирус связывается с рецептором на поверхности клетки (рис. 2) [9]. Разные серотипы ААВ предпочтительно связываются со своими рецепторами, характерными для определенных типов клеток [10].
Рисунок 2. Проникновение ААВ внутрь клетки. Пояснения в тексте.
[9], рисунок с изменениями
И это важное свойство — определенный серотип преимущественно проникает лишь в конкретную ткань или орган, то есть обладает своим уникальным тропизмом.
Связывание вируса с рецептором запускает процесс проникновения внутрь клетки. Эндосома (мембранный пузырек, содержащий вирусную частицу) передвигается в цитоплазме по цитоскелету. Постепенно среда в эндосоме закисляется, что приводит к изменениям капсида, необходимым для дальнейшего успешного заражения клетки. После выхода из эндосомы у вируса два пути. Либо он попадает в клеточную машину по уничтожению белков (протеасому) и разрушается, либо переносится в ядро, где вирусный геном высвобождается из капсида (рис. 2) [10].
С одноцепочечного вирусного генома еще не могут нарабатываться белки, для этого необходимо достроить вторую цепь ДНК. Она синтезируется с помощью ДНК-полимеразы клетки-хозяина, используя шпильку ITR в качестве затравки для построения второй цепи.
Вирусные ITR помогают не только строить вторую цепь ДНК, но способствуют межмолекулярной и внутримолекулярной рекомбинации геномов вируса. В результате в ядре клетки образуются кольцевые молекулы ДНК — эписомы (рис. 2). В такой форме геномы ААВ могут в течение многих лет присутствовать в ядре [10].
Кроме того, геном ААВ может с низкой частотой встраиваться в определенный локус на 19 хромосоме человека [11]. Этот феномен обусловлен сходством последовательностей ДНК данного локуса и ITR вируса. У ААВ, лишенного гена rep, способность к встраиванию своего генома сильно снижена. Такие вирусные геномы присутствуют в клетках в виде эписом.
Модификация ААВ для применения в генной терапии
Если в гене человека произошла мутация, которая привела к развитию заболевания, то болезнь можно победить или облегчить, если доставить в клетки организма рабочую копию поломанного гена. Вот тут и выходит на сцену аденоассоциированный вирус.
Что же нужно было в нем изменить, чтобы он стал курьером для доставки таких терапевтических генов? Как это часто бывает в биологии, ученые просто воспользовались успешными решениями, уже созданными природой. Раз капсид ААВ сам по себе является ключом к входу в клетку и ядро, то можно смело этим воспользоваться. Остается только заменить гены самого вируса на гены, интересующие исследователя, и вирусный курьер готов!
Модификация генома ААВ
Оказалось, что от всего генома ААВ необходимо было оставить только концевые шпильки ITR, необходимые для сборки самого вируса и сохранения его генома в ядре (рис. 3) [12]. Таким образом, можно без последствий удалить до 96% генома ААВ, используя полученное пространство для кодирования нужных генов.
Так как ААВ вмещает в себя всего около 5000 пар нуклеотидов, то нужно очень тщательно продумать остальной состав кассеты. В первую очередь туда необходимо поместить рабочую копию гена (трансген), в зависимости от того генетического заболевания, на которое направлено лечение. Также обязательно наличие регуляторных последовательностей, таких как промотор и сигнал полиаденилирования (рис. 3). Разберем элементы кассеты подробнее.
Рисунок 3. Компоненты типичной кассеты ААВ вектора. Оранжевые блоки (промотор, трансген и сигнал полиаденилирования — рА) являются обязательными компонентами. Для повышения эффективности экспрессии могут быть включены необязательные регуляторные элементы, такие как интрон (I) и другие компоненты 3′-нетранслируемой области (НТО). Кассета обрамлена инвертированными терминальными повторами (ITR).
рисунок авторов статьи
Из-за ограниченной емкости вируса могут возникнуть трудности с доставкой больших терапевтических генов. Очевидное решение проблемы — разработка сокращенной версии гена, который кодирует усеченный, но функциональный белок. Создание таких укороченных генов требует глубокого понимания биологии терапевтического белка, взаимосвязи его структуры и функции. Такой подход уже успешно применяется в нескольких клинических испытаниях по лечению миодистрофии Дюшенна [13] (ссылки на клинические испытания: NCT03368742, NCT04281485, NCT03769116), в доклинических исследованиях по лечению дисферлинопатии, амавроза Лебера и многих других заболеваний.
Другим потенциально перспективным подходом для доставки слишком больших трансгенов может быть разделение гена между двумя ААВ-векторами [14]. Два этих векторных генома, попадая в одно и то же ядро клетки, могут подвергаться межмолекулярной рекомбинации с последующим восстановлением полноразмерного гена. Такой двухвекторный подход пока применяется лишь в редких клинических испытаниях (пример — NCT02710500). Низкая эффективность восстановления полноразмерного гена ограничивает более широкое применение этого приема.
Правильно выбранный промотор — во многом залог успешной генной терапии. Идеальный промотор должен запускать стабильную высокую экспрессию трансгена в пораженных органах в течение длительного периода, при этом быть неактивным в других тканях. Малая емкость ААВ также требует уменьшения размера промотора [15].
К кассету можно добавить необязательные элементы, способные улучшить экспрессию трансгена (рис. 3). Так, например, присутствие интрона повышает стабильность РНК в ядре [16], а также способствует эффективному транспорту мРНК из ядра в цитоплазму [17].
К обеспечению тканеспецифичности можно подойти с другой стороны — не только стимулируя экспрессию в целевых тканях, но и подавляя ее в нежелательных органах с помощью механизмов РНК-интерференции [18]. Для этого в 3′-НТО-кассеты добавляют сайты связывания микроРНК, присутствующих строго в нецелевых органах (рис. 3) [19]. Если трансген оказывается в нежелательном органе, то микроРНК связывается с комплементарными ей сайтами в транскрипте и запускает его деградацию.
Модификация капсида ААВ
Хотя капсид ААВ — сам по себе уже удачное изобретение природы, человечество не остановилось в своем научном поиске. Новые серотипы ААВ могут обладать рядом преимуществ:
Благодаря развитию новых методов анализа выделяют несколько основных направлений для создания или выявления новых серотипов.
К сожалению, всегда существует вероятность, что хорошо работающий in vitro модифицированный капсид в экспериментах на лабораторных животных продемонстрирует низкую эффективность или даже токсичность. Всестороннее изучение свойств разрабатываемых препаратов и строгий контроль качества призваны минимизировать риск неблагоприятного исхода исследований [23].
Применение ААВ в клинике
Целевые органы, на которые направлена терапия
К 14 декабря 2020 года 227 препаратов на основе ААВ проходят клинические испытания (по данным сайта ClinicalTrials.gov). Сегодня уже существует несколько препаратов на основе ААВ, которые получили одобрение от регулирующих органов для коммерческого использования у пациентов (подробнее про эти препараты можно почитать в [4]):
Большинство серотипов ААВ «предпочитают» проникать в такие органы, как печень, поперечно-полосатые мышцы и ЦНС, что и определило направление большинства программ генной терапии (рис. 4).
Рисунок 4. Данные с сайта ClinicalTrials.gov: на 13 ноября 2018 г. было зарегистрировано 145 клинических испытаний с использованием ААВ. а — Классифицикация клинических испытаний на основе примененного серотипа ААВ (AAV). б — Целевой орган, на который направлена терапия в указанных клинических испытаниях. Можно заметить, что спустя два года количество клинических испытаний с применением ААВ почти удвоилось (227 на сегодняшний день против 145 испытаний два года назад).
Почти все природные серотипы ААВ эффективно заражают печень после внутривенного введения. Благодаря данному свойству вируса в клинических испытаниях находятся препараты для лечения гемофилии A и B (NCT03392974, NCT03587116), семейной гиперхолестеринемии (NCT02651675), дефицита орнитинтранскарбамилазы (NCT02991144), мукополисахаридоза-IIIA (NCT03612869) и синдрома Криглера—Найяра (NCT03223194) [25].
Серотипы ААВ8 и ААВ9 могут эффективно заражать разные типы мышц по всему телу. Такое свойство делает их идеальными векторами для генной терапии множества мышечных заболеваний [26]. Так, активно исследуются в клинике препараты для лечения миодистрофии Дюшенна (NCT03375164), дисферлинопатии (NCT02710500), миотубулярной миопатии (NCT03199469), болезни Помпе (NCT03533673). Примечательно, что зараженная мышца может также служить биофабрикой для производства секретирующихся терапевтических белков для лечения немышечных заболеваний. Хотя большинство сердечных заболеваний полигенны и подвержены влиянию окружающей среды, ведется разработка препаратов генной терапии для лечения сердечной недостаточности [26].
Большой процент разрабатываемых препаратов на основе ААВ направлен на лечение неврологических и глазных болезней (рис. 4) [27], [28]. Глаз — весьма обособленный орган, обладающий уникальной иммунологической толерантностью, и легко доступный для прямого введения препарата. Нетрудно понять, почему один из первых одобренных препаратов, «Люкстурна», был направлен именно на лечение наследственной слепоты. Мозг, напротив, намного более крупный и сложно организованный орган. Прямая доставка препарата в мозг или спинномозговую жидкость позволяет локализовать вирус и снизить дозу препарата, но это инвазивная процедура, сопряженная со многими рисками. К счастью, такие серотипы, как ААВ9 или ААВrh.10, могут пересекать гематоэнцефалический барьер, что позволяет использовать рутинное внутривенное введение. В настоящий момент в клинических испытаниях уже находятся препараты для лечения болезни Паркинсона (NCT02418598), метахроматической лейкодистрофии (NCT01801709), болезни Баттена (NCT01414985), мукополисахаридоза 3 типа (NCT03300453).
Основные стратегии генной терапии на основе рААВ
Можно выделить 4 глобальных направления генной терапии с применением ААВ (рис. 5).
Рисунок 5. Основные стратегии генной терапии на основе ААВ. Пояснения в тексте.
[29], рисунок с изменениями
Производство ААВ
Когда речь идет о клинических испытаниях, требуется очень большое количество вирусного препарата высокого качества. Его производство — весьма нетривиальная задача.
Вирусы не могут самостоятельно себя воспроизводить, им необходима помощь клеточной машинерии. Для наработки ААВ стали использовать культуры клеток. Вариантов может быть много: использование культуры дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) [33], клеток насекомых (культура клеток Sf9 бабочки Spodoptera frugiperda) [34], человека — HEK293, HeLa. Некоторые из этих подходов, — скорее, экзотика, но использование культур клеток млекопитающих (HEK293) или насекомых (Sf9) уже прочно закрепилось на производстве.
Итак, для начала необходимо определиться с методикой производства, ведь от этого зависит, в чем будет расти сама культура. Вариантов масса: для клеток, растущих, прикрепившись к субстрату, это могут быть большие чашки Петри, специальные сосуды с множеством перегородок для увеличения площади поверхности (рис. 6а). Для культур, хорошо чувствующих себя в виде суспензии и при постоянном перемешивании, — колбы, герметичные пакеты и многое другое. При увеличении масштабов производства можно переходить на специальные биореакторы (рис. 6б). С их помощью можно следить за целой панелью важных для процесса параметров. Они делают производство более технологичным и позволяют увеличить объемы продукции до нескольких сотен литров вирус-содержащей суспензии за один цикл работы.
Рисунок 6. Производство ААВ: на культуральных чашках (а) и в биореакторе iCellis Nano (Pall corporation) (б)
фотографии авторов статьи
Что нужно сделать с культурой клеток, чтобы она стала биофабрикой по производству вирусных частиц? В такие клетки-производители вносят плазмидную ДНК, кодирующую необходимую для сборки вирусов информацию. Наиболее популярный протокол предполагает одновременное заражение клеток тремя плазмидами (рис. 7):
Кстати, вместо третьей плазмиды может быть добавлен сам вирус-помощник (аденовирус или герпесвирус), как это было в более ранних протоколах по производству частиц ААВ [35].
Рисунок 7. Производство ААВ, использующее в качестве клеток-производителей культуру клеток человека HEK293. Смесь трех плазмид доставляют внутрь клетки (плазмиду с терапевтическим геном, плазмиду, кодирующая гены rep/cap, и плазмиду с генами вируса помощника). Начинается наработка необходимых белков для сборки вирусных частиц. ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается в готовый капсид ААВ.
Клетки начинают производить вирусные частицы, после чего их надо собрать и очистить.
Это критически важный этап, которому стоит уделить особое внимание [22], [23]. Любые примеси, которые будут содержаться в препарате, могут вызвать нежелательный иммунный ответ.
Вначале собирают сырой материал: это может быть клеточная среда, если вирусы выделяются клетками преимущественно в жидкость вокруг, а могут быть и сами клетки, если большинство вирусных частиц накапливается внутри. Как правило, это зависит от конкретного серотипа ААВ. Чтобы разрушить клеточные мембраны и высвободить вирус, клетки подвергают многочисленным циклам замораживания-оттаивания, ультразвуковой обработке или воздействию детергентов.
Теперь основная задача — очистить вирусные частицы от многочисленных примесей, находящихся в суспензии (рис. 8). В сыром материале находятся внутриклеточные свободные ДНК и РНК, белки и ферменты, крупные обломки клеточных мембран и многое другое. Способов очистки существует множество, и постоянно появляются как улучшенные версии уже применяемых методик, так и принципиально новые подходы. Все они различаются по уровням специфичности, эффективности и, разумеется, стоимости. Условно способы очистки можно разделить на серотип-специфичные и универсальные. К первой категории относится, например, аффинная хроматография [37], основанная на специфическом узнавании капсидов антителами. Ко второй — ультрацентрифугирование в градиентах плотности растворов йодиксанола или хлорида цезия, преципитация полиэтиленгликолем или сульфатом аммония, ионообменная хроматография и многие другие методы, основанные на общих физических свойствах вирусных частиц [38].
Рисунок 8. Окрашивание серебром очищенного (лунки 1–3) и загрязненного другими белками (лунки 4–8) препарата ААВ после гель-электрофореза [38].
Одна из неочевидных нежелательных примесей — так называемые пустые капсиды — вирусные частицы, не несущие в себе терапевтический ген, или содержащие внутри себя постороннюю ДНК. Дело в том, что изначально в клетке формируется пул пустых капсидов. Лишь потом ДНК связывается с пустым капсидом при помощи специальных сигналов на ITR и компактно упаковывается, формируя полноценную вирусную частицу. Но иногда пустой капсид может так и остаться пустым при нехватке вирусной ДНК или ее неэффективной упаковке. В пустой капсид может также упаковаться обрывок свободной ДНК, находящейся в клетке и содержащей последовательность, схожую с сигналом упаковки. Такие частицы (совсем пустые или несущие неправильную последовательность) не функциональны и подлежат удалению из очищаемого препарата. С определенной эффективностью их можно отделить от функциональных капсидов, используя градиенты плотности или методы хроматографии.
Основные проблемы
Наработка большого количества плазмид высокой степени очистки, поддержание культур клеток, дорогостоящие реактивы, сложный процесс очистки вирусных частиц и разработка аналитических методик для характеризации препаратов ведут к таким космическим ценам при масштабировании производства. На стоимость также влияет серьезный контроль качества вирусного препарата. Чтобы препарат вышел на рынок, проводятся исследования его токсичности, безопасности, биораспределения, эффективности. Оценивается содержание белковых примесей, бактериальных эндотоксинов, количество пустых капсидов, стерильность препарата, концентрация вирусных частиц в растворе и множество других характеристик [23]. В настоящий момент гиганты производств ААВ по всему миру работают над удешевлением препаратов, разрабатывая более эффективные протоколы сборки и очистки ААВ.
Иммунный ответ также представляет собой серьезную проблему. Потенциально иммунные реакции могут возникать на вирусный капсид, его геном, а также на белковый продукт трансгена. Препаратам на основе ААВ могут помешать нейтрализующие антитела к его капсиду [39]. Связываясь с вирусами в кровотоке, антитела препятствуют проникновению вирусных частиц в клетки, что ведет к низкой эффективности препарата. В настоящий момент обязательно проводится скрининг пациентов на наличие антител к применяемому серотипу ААВ [40]. В случае их обнаружения такой пациент исключается из клинических испытаний. Ведется разработка новых капсидов, которые не будут узнаваться нейтрализующими антителами [41]. После доставки терапевтических доз ААВ быстро развивается гуморальный иммунный ответ, который впоследствии помешает повторному введению препарата [42]. Именно поэтому большинство генотерапевтических препаратов на основе ААВ рассчитано на однократное введение. Для подавления Т-клеточного иммунного ответа у пациентов применяется фармакологическая супрессия стероидами [40].
Заключение
Генная терапия на основе ААВ — бурно развивающееся направление, и мы в данном обзоре затронули лишь небольшой кусочек этой удивительной области. Текущий экспоненциальный рост клинических испытаний с использованием ААВ предполагает, что мы находимся в самом начале эры новых генотерапевтических препаратов. Еще очень много задач предстоит решить, и для этого требуются мультидисциплинарные усилия. Дальнейшее развитие молекулярной биологии, биоинформатики, эпидемиологии, структурной биологии, иммунологии, геномики и других дисциплин, безусловно, будет способствовать совершенствованию технологии. Уже пройден длинный путь в попытке человечества победить генетические заболевания. Мы надеемся, что именно генная терапия приведет к окончательной победе!