Микрококки (Micrococcus) — род грамположительных бактерий. Имеют форму сферы от 0,5 до 3 мкм в диаметре. Микрококки неподвижны. В природе распространены повсеместно: в почве, пыли, в воде. Особенностью микрококков является способность к развитию при низких температурах.
Micrococcus antarcticus приспособлены к существованию в антарктических условиях. Отличается тем, что оптимальная температура роста 16±8°С, а могут расти и при 0°С (для сравнения, оптимальная температура роста для Micrococcus luteus и Micrococcus lylae — 37°С).
Микрококки в организме человека
Большое количество микрококков обитает на коже человек, они также встречаются в дыхательных путях, в ротовой полости. Чаще всего микрококки не вызывают каких-либо заболеваний, однако они могут быть причиной оппортунистических инфекций, особенно у индивидуумов с ослабленным иммунитетом, например, у ВИЧ-инфицированных.
В исследовании, проведённом в Твери, Micrococcus spp. выделены из слизистой оболочки тела желудка у 22% здоровых детей (Апенченко Ю.С. и др.)
Микрококки в систематике бактерий
По современной классификации род Micrococcus входит в семейство Micrococcaceae, порядок Micrococcales, класс Actinobacteria, тип Actinobacteria, царство Бактерии. В род микрококки включены виды: Micrococcus aerogenes, Micrococcus alkanovora, Micrococcus aloeverae, Micrococcus antarcticus, Micrococcus chenggongense, Micrococcus cohnii, Micrococcus endophyticus, Micrococcus flavus, Micrococcus indicus, Micrococcus leteus, Micrococcus luteus, Micrococcus lylae, Micrococcus terreus, Micrococcus thailandicus, Micrococcus xinjiangensis, Micrococcus yunnanensis.
Колонии Micrococcus luteus на агаре LB (лизогенном бульоне)
Научная классификация
Micrococcus Cohn, 1872 emend. Stackebrandt et al., 1995
Представители рода Micrococcus — маленькие грамположительные сферические клетки, которые располагаются поодиночке или в неправильных скоплениях, в большинстве своем неподвижные. На плотных питательных средах образуют круглые, гладкие колонии белого, желтого или красного цвета. Яркий цвет обусловлен выделением окрашенного продукта в окружающую среду или пигментацией самой клетки (окраска может использоваться как характерный признак).
Содержание
Род Micrococcus на сегодняшний день фактически насчитывает 8 видов. Здесь перечислено 15 видов, поскольку, хотя еще 7 находятся в других таксономических группах, они считаются синонимами бывших представителей описываемого рода, и в современных микробиологических работах до сих пор могут описываться как Micrococcus.
Физиология
Micrococcus — облигатные аэробы, сапрофиты или факультативные паразиты, патогенных видов нет. Все хорошо растут на питательном агаре. Пигменты, образующиеся микрококками, не диффундируют в среду и нерастворимые в воде. Деление клетки происходит в любом направлении. Как правило, микрококки неподвижны и не образуют эндоспор. Все микрококки содержат «животный крахмал» гликоген, который выполняет роль запасного вещества клетки. У большинства видов оптимум температуры роста 25—30 ° С. Многие виды микрококков могут развиваться при 5—8 ° с. Отдельные виды выдерживают нагревание до 63—65 ° С в течение 30 мин. и кратковременную пастеризацию при высокой температуре. Микрококки могут быть обнаружены на коже, в ротовой полости, дыхательных путях человека и животных, иногда на коньюктиве и половых органах. В природе распространены повсеместно — в почве, воздухе, пресных и соленых водоемах, а также в пищевых продуктах.
Систематика, история
Первый вид рода Micrococcus Micrococcus luteus был впервые описан в 1872 году немецким микробиологом Робертом Кохом. M.luteus стал типовым видом для рода микрококков.
Большой вклад в систематику кокков внес английский микробиолог Бэйрд Паркер, исследовавший свыше тысячи культур кокков, выделенных из самых разных источников — почвы, воздуха, молока, поверхности растений, организма человека и животных. Сначала все исследуемые культуры кокков были отнесены им к трем родам — Staphylococcus, Micrococcus и Sarcina; в свою очередь, каждый род был разделен на несколько групп на основании физико-биохимических особенностей. В 1964 году подкомитетом по таксономии Micrococcaceae было официально принято разграничение родов Staphylococcus и Micrococcus на основании анаэробной ферментации глюкозы: представители рода Staphylococcus способны в анаэробных условиях ферментировать глюкозу с образованием кислоты, тогда как культуры рода Micrococcus не обладают таким свойством. Принадлежность культур к роду Sarcina устанавливалась по способности кокков образовывать правильные пакеты клеток. Однако, и Бейрд Паркер, и другие авторы отказались от выделения аэробных пакетообразующих кокков в самостоятельный род Sarcina.
Позже исследования показали, что анаэробная ферментация глюкозы не является надежным признаком разграничения микрококков и стафилококков. Благодаря изучению нуклеотидного состава ДНК чешскими учеными (Коцур, Мартинек, Мазанек и др.) удалось установить, что у представителей рода Staphylococcus молярный процент ГЦ (Гуанин + Цитозин) в ДНК колеблется от 30,7 до 36,4, тогда как у представителей рода Micrococcus — от 65 до 75. Впоследствии было предложено расширить границу колебаний величины ГЦ для рода Micrococcus от 57 до 75 мол.%. Культуры микрококков, в которых содержание ГЦ был значительно ниже предела, установленного для Micrococcus (39—51 мол.%), было предложено выделить в особый род — Planococcus.
По физиологическим и культуральным признакам и нуклеотидному составу ДНК аэробные сарцины не отличаются от микрококков. На основании этого было предложено аэробные пакетообразующие кокки исключить из рода Sarcina и перенести их в род Micrococcus. Родовое название Sarcina, в таком случае, сохраняется за анаэробными видами сарцин, которые стабильно образуют пакеты, и имеют в составе оснований ДНК 28—30 мол.% ГЦ.
На основании всех вышеперечисленных признаков род Micrococcus был отделен от сарцин и стафилококков. Также, в последнее время для оценки принадлежности штамма к определенному роду кокков в спорных ситуациях используют анализ состава клеточной стенки и содержания менахинонов (витамин K2) в клетке.
Микроорганизм Kocuria varians до 1995 г. назывался Micrococcus varians (это название врачам более знакомо).
Информацию о том, что он может вызвать гинекологические инфекции, не встретила. Но зато есть публикации, что иногда при идентификации микроогранизма с использованием автоматических тест-систем за Kocuria varians могут приниматься так называемые коагулазо-негативные стафилококки (Staphylococcus epidermidis и др.), так как по своим свойствам эти микроорганизмы очень похожи.
Ссылки для коллег: [ Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] [ Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ]
Глава 2. КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ. ТАКСОНОМИЯ
2.1. ТАКСОНОМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Систематика – наука о разнообразии организмов и их взаимоотношениях друг с другом. Задачи систематики – описание, определение видов и их классификация, восстановление путей эволюционного развития организмов.
Системы могут быть искусственными, естественными и филогенетическими. В искусственных системах объединение видов строится на основе одного или немногих общих морфологических признаков. Такие системы не всегда отражали генетические связи между группами организмов. Венцом искусственных систем явилась система органического мира, созданная К. Линнеем. В ней бактерии и некоторые другие организмы были отнесены к XXIV классу, получившему название «хаос». Естественные системы основаны на сходстве большого количества признаков (не только морфологических). На основе естественных создаются филогенетические системы, в которых отражаются эволюционные связи между организмами.
Для классификации микроорганизмов, как и других живых существ, применяются разнообразные методики, однако наиболее объективным считается метод анализа ДНК.
Метод анализа ДНК. Процентное содержание суммы гуанина и цитозина (Г + Ц) в ДНК использовалось в бактериальной таксономии в течение нескольких десятилетий, а ее использование в комбинации с анализом последовательностей 16S- и 5S-pPHK делает этот метод еще более значимым.
При использовании анализа 16S-pPHK грамположительные эубактерии делятся на две группы на уровне типа: одна группа с Г + Ц > 55 мол. %, другая с Г + Ц w = 0,65. Образует слизь на сосисках и сардельках, растет в рассолах и на сырах и вызывает порчу концентрата апельсинового сока и йогурта.
Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается штамма бактерий, продуцирующего новую сайт-специфическую эндонуклеазу KroI. Предложен штамм бактерий Kocuria rosea 307, выделенный из почвы и обеспечивающий получение сайт-специфической эндонуклеазы KroI. Эндонуклеаза KroI узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GCCGGC-3’/3′-CGGCCG-5′, в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5 с образованием четырехнуклеотидных 5′-выступающих концов. Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г\л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 1000 ед./мл. 2 ил.
Эндонуклеаза, обладающая данной специфичностью, может быть использована для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей 5-метилцитозиновые основания.
К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.
Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2], Bacillus subtilis 230 [3] и Glacial ice bacterium 24 [4], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы BlsI, BisI и GluI, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность 5′-GCNGC-3′, при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозиновых оснований.
В настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5′-GC(m5C)GGC-3’/3′-CGG(m5C)CG-5′.
Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза не может расщеплять узнаваемую последовательность при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.
Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GC(m5C)GGC-3’/3′-CGG(m5C)CG-5′.
Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.
Полученный штамм Kocuria rosea 307 депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО «СибЭнзим» под регистрационным номером 7М98, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа KroI.
Штамм Kocuria rosea 307 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки кокковидные, размером порядка 1-2 мкм в диаметре. Спор не образуют. Грамположительные.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Растут при температуре от 10 до 40°С, при рН от 6 до 9.
Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [6], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента гена 16S РНК по программе BLAST [7] как вид бактерии Kocuria rosea (старое видовое название Micrococcus roseus). Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза названа согласно номенклатуре [8].
Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г\л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.
Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы.
Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза (рестриктаза) характеризуется следующими с свойствами:
2. Расщепляет связи перед первым цитозином в обеих цепях узнаваемой последовательности.
3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, если хотя бы один из центральных цитозинов не метилирован.
4. Оптимальная температура действия 37°С.
5. Оптимальное значение рН для действия фермента 8,0-9,0.
6. Гидролиз ДНК максимально эффективен при концентрации ионов NaCl 0-10 мМ.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GCCGGC-3’/3′-CGGCCG-5′, при условии метилирования в узнаваемой последовательности двух центральных цитозинов. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза KroI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов, в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании 150 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С на центрифуге «Beckman» (США) в роторе JA-10. Выход биомассы составляет 5 г/л среды.
Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [8].
Сайт-специфический гидролиз метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой KroI
В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7, плазмид pBR322, pHspAI1 (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)GC-3’/5′-G(5mC)GC-3′ [1]), и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)NGC-3’/5′-G(5mC)NGC-3′ [4]). Отдельно с помощью SssI метилазы проводили метилирование всех 5′-СG-3′-динуклеотидов в плазмиде pBR322 и проводили гидролиз такой метилированной плазмиды эндонуклеазой KroI.
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7, а также плазмид pBR322, pHspAI1 и pFsp4HI3 эндонуклеазой KroI.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.1:
Как видно из фиг.1, KroI не расщепляет ДНК фага лямбда, плазмид pHspAI1 и pFsp4HI3, а также плазмиды pBR322, если она не метилирована метилазой M.SssI. Во всех этих ДНК-субстратах отсутствует метилированная последовательность 5′-GС(m5С)GGС-3’/3′-СGG(m5С)СG-5′, необходимая для узнавания эндонуклеазой KroI. Однако после обработки ДНК фага лямбда и плазмиды pBR322 метилазой SssI эндонуклеаза KroI расщепляет метилированную ДНК. Картина гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазами AspA2I и MroNI совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI метилированных продуктов расщепления ДНК фага лямбда рестриктазой AspA2I. Аналогично картина гидролиза плазмиды pBR322 рестриктазой MroNI совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI, метилированной ДНК pBR322.
Эти два примера совпадения картин гидролиза метилированной и неметилированной ДНК эндонуклеазами MroNI и KroI соответственно подтверждают, что эти две эндонуклеазы узнают одну и ту же последовательность ДНК 5′-GCCGGC-3’/3′-CGGCCG-5′, причем MroNI может расщеплять эту последовательность только в отсутствие CG-метилирования сайта узнавания, a KroI, наоборот, только при наличии CG-метилирования узнаваемой последовательности. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза KroI способна узнавать и расщеплять метилированную последовательность ДНК 5′-GC(m5C)GGC-3’/3′-CGG(m5C)CG-5′.
Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой KroI
Для подтверждения правильности определения узнаваемой последовательности и определения позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания проводили гидролиз синтетических олигонуклеотидных дуплексов, образованных из олигонуклеотидов следующей структуры:
Олигонуклеотиды 307-1 и 307-3 комплементарны олигонуклелеотидам 307-2 и 307-4. Дуплексы 307-1/307-2 и 307-3/307-4 имеют сходную последовательность и отличаются друг от друга только наличием или отсутствием 5-метилцитозинов в последовательности 5′-GCCGGC-3’/3′-CGOCCG-5′.
Определение места гидролиза ДНК рестриктазой KroI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазой рестрикции MroNI неметилированного олигонуклеотидного дуплекса 307-1/307-2, образованного из олигонуклеотидов 307-1 и 307-2, и эндонуклеазой KroI метилированного дуплекса 307-3/307-4, образованного из олигонуклеотидов 307-3 и 307-4. В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ЕхоIII из E.coli.
Дуплексы 307-1/307-2 и 307-3/307-4 отличаются друг от друга только наличием или отсутствием метильной группы в первом цитозине последовательности 5′-GCCGGC-3′ в обеих цепях дуплекса.
На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченных дуплексов 307-1*/307-2 (знаком «*» указан меченый олигонуклеотид) и 307-3*/307-4 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину. Как видно из фиг.2, фрагменты ДНК образованные гидролизом MroNI и KroI соответствующих дуплексов имеют одинаковую длину, что говорит об идентичности позиций гидролиза этих ферментов узнаваемой последоватльности.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в палиндромной последовательности 5′-GC(m5C)GGC-3′ эндонуклеаза KroI расщепляет ДНК перед первым цитозином узнаваемой последовательности с образованием четырехнуклеотидных 5′-выступающих концов. Выход сайт-специфической эндонуклеазы KroI определяют по электрофоретической картине расщепления метилированной CG-метилазой SssI ДНК плазмиды pBR322. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК данной плазмиды в течение 1 часа при температуре 37°С в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 1000 ед./мл.
Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу KroI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GCCGGC-3’/3′-CGGCCG-5′, в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5, с образованием четырехнуклеотидных 5′-выступающих концов. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.
