micromycetes spp кампестерол что это такое
Микроэкологические исследования человека по методу газовой хроматографии масс-спектрометрии микробных маркеров
Метод масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике
Микроэкологические исследования человека по методу хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров
Общая информация о методе
Применение газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ХМС) используется для определения в биологических пробах человека компонентов клеточных стенок микроорганизмов, так называемых микробных маркеров из числа высших жирных кислот. У каждого микроорганизма есть «свои», т.е. характерные только ему маркеры, при обнаружении которых делаются заключения о присутствии тех, или иных микробов с их количественной оценкой. Это используется для определения инфекционных агентов воспалений и оценки дисбиозов различных локализаций.
Метод был разработан в России группой ученых под руководством доктора биологических наук, профессора микробиологии Осипова Георгия Андреевича. С 1991 года метод используется в медицине, экологии и биотехнологии, в основном, при научных исследованиях. Научная обоснованность метода заключена в четырнадцати кандидатских, докторских диссертациях и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах. Она обусловлена получением беспрецедентно большого объема информации о действующих в воспалительных процессах и при дисбиозах бактериях, особенно из числа анаэробов, некультивируемых в клинических лабораториях аэробов, а также актинобактерий, дрожжей, микроскопических грибов и вирусов.
Основные преимущества методики Хромато-масс-спектрометрии (ХМС) микробных маркеров:
Характеристика микробиологического анализа
Метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010) является надежным количественным экспресс-методом диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции. Принципиальное отличие метода в количественном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов) непосредственно в клиническом материале, что придает ему качественно новое свойство – возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров.
Основные характеристики метода:
Метод МСММ дает возможность быстро получить расширенную информацию об анаэробах и трудно культивируемых аэробах, а также актинобактериях, вирусах, дрожжах и микроскопических грибах из одной пробы обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания.
Метод МСММ лишен недостатков классических методов диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике:
В отличие от бактериологических исследований
В отличие от иммуно-серологических испытаний
В отличие от молекулярно-биологических методов
Метод прошел многолетнюю апробацию и эффективно используется во многих медицинских учреждениях. Вот только немногие из них:
О МЕТОДЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОФЛОРЫ ПО ОСИПОВУ Г.А.
О востребованности метода МСММ
Существующая методология микробиологического обследования пациента в клинических лабораториях по разным причинам сводится к анализу всего лишь десятка родов аэробных микроорганизмов из числа энтеробактерий, аэробных кокков и псевдомонад. Невольно игнорируется большинство клинически значимых микробов из числа аэробных актинобактерий, всех анаэробов и других трудно культивируемых микроорганизмов. Число неучтенных при обследовании каждого больного составляет сотни видов, так, как давно известно, что в организме человека и в окружающей среде присутствует более пятисот видов, способных вызвать инфекционных процесс или воспаление. Пользуясь информационной мощью сети Интернет нетрудно показать, что каждый микроб является потенциально патогенным. На сегодня не вызывает сомнений, что инфекции и воспаления не являются моноэтиологичными, рано или поздно выясняется участие в них группы микроорганизмов, объединенных в генетически и трофически организованные сообщества, называемые биопленками.
В такой ситуации аэробы, являющиеся основным объектом работы клинических лабораторий, представляются лишь как биологические маркеры основной инфекции, вызванной анаэробами.
Таким образом, существующая практика клинических бактериологических исследований имеет малую информативность и сомнительную пользу для лечения заболеваний микробной этиологии. Выход из сложившейся ситуации виден либо в расширении и углублении процедуры обследований культурально-биохимическим методом с обязательным включением в постоянную практику анаэробов и актинобактерий с усовершенствованием техники отбора проб, либо во внедрение новых технологий микробиологического анализа, лишенных недостатков, связанных с необходимостью получения биомассы живых микроорганизмов в искусственных условиях.
Газовая хроматография – масс-спектрометрия
Пятнадцатилетний опыт применения метода микробных маркеров в клиниках городов Москвы и Санкт-Петербурга показал его практическую пользу в диагностике и лечении простых и сложных патологий. Она обусловлена получением беспрецедентно большого объема информации о действующих в воспалительных процессах и при дисбиозах бактериях, особенно из числа анаэробов и некультивируемых в клинических лабораториях аэробов, а также актинобактерий, дрожжей и микроскопических грибов. Новизна аналитической процедуры, новизна и объем информации обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания каждого без исключения из тысяч обследованных пациентов, с одной стороны. С другой – требует от врача принципиально новых подходов в лечении больных на основании измененных представлений о микробной экологии человека в норме и патологии.
Метод становится все более востребованным, потому, что он информативный, экспрессный и экономически эффективный. А самое главное – дает ощутимое преимущество в вылечивании хронических заболеваний, преодолении септических состояний и выяснении причин лихорадок неизвестной этиологии, а также существа нарушений общего микроэкологического гомеостаза организма человека.
Метод ХМС как диагностический инструмент:
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Применение масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) для изучения микроэкологии человека дает качественно новый вариант микробиологического исследования благодаря возможности одновременного количественного определения более сотни микробных маркеров непосредственно в биологических пробах без предварительного культивирования микроорганизмов и использования биохимических тестовых материалов и генетических праймеров. Получение в реальном времени расширенной информации об анаэробах и трудно культивируемых аэробах, а также актинобактериях, вирусах, дрожжах и микроскопических грибах из одной пробы обеспечивает полное понимание микробной этиологии заболевания. Количественные измерения методом МСММ позволяют изучать динамику изменения микробиоты при лечебных мероприятиях, в том числе – влияние антибиотиков и пробиотиков на пристеночную микробиоту кишечника.
Введение
С современных позиций, нормальную микробиоту человека рассматривают как совокупность микробных сообществ локусов, характеризующихся определенным составом и колонизирующих кожу и слизистые оболочки. Нормальная микробиота – тот первичный неспецифический барьер, лишь после прорыва которого инициируется включение всех последующих неспецифических и специфических факторов защиты макроорганизма. На рубеже ХХI века сформировалось представление о микрофлоре организма человека как о еще одном органе, покрывающим в виде чулка кишечную стенку, слизистые оболочки и кожу человека. Оставаясь невидимым, этот «орган» весит около двух килограммов и насчитывает порядка 10 14 клеток (сто биллионов) клеток микроорганизмов. Это число в десять раз превышает число собственных клеток человека. Микробиота выступает как чуткий индикатор физиологического состояния организма человека в зависимости от воздействия на него различных факторов.
На сегодня нет точного описания архитектуры микробного сообщества пристеночного слоя кишечника. Но известны данные, согласно которым микроорганизмы, в количестве 10 11 клеток/см 3 [9] распределены в пристеночном слое муцина [3, 20], прочного геля, состоящего из пептидогликана, продуцируемого бокаловидными клетками эпителия кишечной слизистой оболочки. Он близок по химической природе полисахаридной защитной капсуле, которой окружают себя многие микробы. Такая среда выглядит пригодной для существования микроорганизмов в тонких слоях муциновой слизи в виде равномерно распределенных клеток на достаточно близком расстоянии (порядка размера микробной клетки) друг от друга. Такое расположение должно обеспечивать контакт с диффундирующим в муцин химусом и клетками между собой для быстрого обмена продуктами метаболизма. Специальные исследования показали, что в биопленке по иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид – кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Последнее получило специальное определение как социальное поведение (quorum sensing) микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише. В организме человека специфическое преимущество такой организации заключается в обеспечении гомеостаза органов, функциональность которых зависит от населяющих их микробов.
Не лишено смысла рассматривать микробное соообщество любых слизистых оболочек в определенной мере подобной кишечнику организованной биопленке. Поводом к тому является стабильность состава каждого из этих микробиоценозов: гомеостаз микробных маркеров имеет место не только в крови [1, 15], но и в вагинальном содержимом женщин и эякуляте мужчин [4].
Микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, является необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем.
Соответственно, одним из первых мероприятий по обеспечению качества и продолжительности жизни, а тем более в лечении любых заболеваний, особенно клинических отделениях реабилитации и интенсивной терапии, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным. В этом можно найти сходство во мнениях в современных публикациях [5, 8, 12, 27]. Микробиота человека сконцентрирована в основном в кишечнике. Сведения о природе микробиоценоза кишечника, накопленные к настоящему времени, выглядят достаточными для понимания его функционирования, как физиологически активного органа человека. Однако для их реализации в управлении этим органом при патологиях, причинно-следственным образом связанных с дисбиозом, недостает количественного метода определения изменений в составе достаточно широкого круга ключевых микроорганизмов и их мониторинга в процессе коррекции. Причем желательно анализировать состав пристеночной кишечной микробиоты, а не микробиоты фекалий, как это принято повсеместно. Именно в мукозном слое, облегающем слизистую оболочку кишечника, происходит усвоение пищевого химуса, поступающего из желудка, синтез микроорганизмами большого числа биологически активных веществ: ферментов, витаминов, иммуностимуляторов, но также и токсичных для человека веществ. Предполагается, что отсутствие баланса в их продукции связано с патологическими проявлениями самого разного характера: кишечными расстройствами, кожными заболеваниями, половой дисфункцией и сердечной недостаточностью.
Материал и методы исследования
Контроль микроэкологического статуса человека сейчас уже является проблемой практического здравоохранения. Следует признать, что классические бактериологические методы затруднительно использовать для ее эффективного решения. Контролировать состав пристеночной микробиоты кишечника и других органов оказалось возможным с помощью метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) по содержащимся в их клеточной стенке длинноцепочечным жирным кислотам и жирным альдегидам фосфолипидов. Известно, что состав жирных кислот микроорганизмов видоспецифичен и используется для их идентификации в чистой культуре [18]. Кроме того, у многих микробов имеются индивидуальные маркеры специфичные для таксонов разного уровня (семейства, рода или вида), по которым их можно определять количественно в объектах окружающей среды и клинических пробах [9]. Существо анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из образца, подлежащего исследованию (например, биоптата кишечной стенки или крови), их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. На основании этих измерений расшифрован состав микробиоты пристеночного мукозного слоя этих отделов кишечника, а также фекалий [3]. Данные по фекалиям оказались в полном количественном соответствии с литературными, что послужило основанием для верификации метода ГХ-МС в применении к другим объектам исследования, но сразу по всем микроорганизмам в одном анализе и с большой точностью по сравнению с культуральным и, пожалуй, генетическим (FISH) методами [9].
Одновременное исследование крови тех же пациентов, а также доноров показало соответствие состава минорных ЖК, альдегидов и стеролов в биоптатах тонкой кишки и в крови.
Метод около пятнадцати лет проходил апробацию в медицинских учреждениях Москвы. В 2010 г. Росздравнадзором разрешено его применение в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).
Результаты и их анализ
Обнаруженный в результате систематических исследований гомеостаз микробных маркеров в крови [1, 15] и адекватность его профиля составу кишечной микробиоты здорового человека обеспечил уникальную возможность мониторировать состояние микробиоты кишечника неинвазивным экспрессным методом – по анализу крови.
Микробная этиология заболеваний кожи
Микробная этиология заболеваний кожи и многих внутренних органов уже изучалась в процессе клинической апробации метода МСММ, которые позволили не только получить дополнительные сведения об агентах инфекции, но и получить подтверждение о транслокации микроорганизмов кишечника в очаг воспаления.
Наблюдение за микробиотой тонкого кишечника при таких кожных заболеваниях как себорея, акне и атопический дерматит дает подтверждение о нозологической специфичности дисбактериоза кишечника. Так у больных себорейным дерматитом при дефиците Lactobacillus и Propionibacterium в кишечнике высока концентрация маркеров клостридий группы C.ramosum и видов Eubacterium (рис. 1). При угревой болезни (акне) наблюдается дефицит Lactobacillus при избыточном росте клостридий группы C.ramosum, Bifidobacterium, вирусов Herpes и других микроорганизмов. При атопическом дерматите в кишечнике регулярно обнаруживается дефицит Bifidobacterium.
Рис.1. Диаграмма масс-спектрометрии микробных маркеров в крови у больных себорейным дерматитом
Метод масс-спектрометрии микробных маркеров, благодаря своей экспрессности и информативности, позволил получить экспериментальные данные, подтверждающие связь ряда заболеваний с изменением микроэкологического статуса организма. Эти данные согласуются с известными данными о связи микробиоты кишечника с кожными заболеваниями [14]. Более того, они позволяют узнать существо изменений микробиоты, причем, именно тонкого кишечника, а не фекалий, как это делалось в предыдущих исследованиях. Для практического врача это означает возможность усовершенствования тактики лечения больных за счет выбора этиотропных антибиотиков для подавления избыточного роста (инфекции) части микробиоты и стимулирования размножения дефицитной группы микробов.
Синдром раздраженного кишечника
При синдроме раздраженного кишечника ( СРК ) наблюдается тотальный дефицит кишечной микробиоты до семикратного снижения общей численности микроорганизмов преимущественно за счет уменьшения численности Lactobacillus, Bifidobacterium и Propinibacterium freudenreichii при избыточном росте Eubacterium и Streptococcus [3]. Кроме того, растет численность анаэробов Bacteroides fragilis, Porphyromonas, Propinobacterium acnes, при периодическом избытке Enterobacteriacae, клос-тридий группы C. ramosum и Eggertellalenta, а также Campylobacter mucosalis, Enterococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus. До лечения у пациента обнаружен избыток C. ramosum, Streptococcus, Nocardia и Actinomyces viscosus при существенном недостатке основных микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника – Lactobacillus, Bifidobacterium, Eubacterium и Propionibacterium (Рис. 2).
Рис.2. Диаграмма масс-спектрометрии микробных маркеров в крови при коррекции дисбиоза жидкими пробиотиками
После лечения с применением некоторых известных жидких пробиотиков микроэкологический статус в основном нормализовался, за исключением того, что Lactobacillus и Propionibacterium freudenreichii не достигли нормы, а численность Eubacterium перешла в избыток. При восстановлении нарушенного микроэкологического статуса оказалось полезным применение иммуномодуляторов (гепон, имуномакс), висмутовых препаратов типа де-нола а также метронидазола, который, как оказалось, кроме подавления внедренных в слизистую оболочку бактероидов стимулирует рост всех микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника.
Примечание редактора: В данном примере жидкие пробиотики – биопрепараты с активизированными чистыми культурами бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, включая пробиотики с органическими формами микроэлементов (Se и I), а также биоконцентраты с холестеринметаболизирующей активностью не применялись. Между тем, использование молочных P. freudenreichii по данным последних исследовний позволяет произвести тонкую модификацию кишечной микробиоты за счет ростовых бифидогеных стимуляторов (bifidogenic growth stimulator (BGS)) таким образом, что в итоге восстанавливается содержание не только самих пропионовокислых бактерий и бифидобактрий, но и лактобацилл, в т.ч. нормализуется баланс КЦЖК (пропионат, бутират, ацетат), а также самонаведение лимфоцитов (снижение Ил-1 β, ИЛ-6 и ФНО-α и увеличение Ил-10), что указывает на противовспалительный эффект.
Инфекции урогенитального тракта
Многочисленные анализы инфекции и дисбиозов методом МСММ при вагинитах выявили ряд типичных случаев:
Полученные данные подтверждают современное представление об инфекциях урогенитального тракта как о полимикробном воспалении. Более того, данные показывают, что ни один из контролируемых таксонов микроорганизмов не сохраняет свою концентрацию в пределах нормы при воспалениях. Здесь понятие таксон может иметь ранг семейства или рода как правило. На самом деле видовое разнообразие микробиоценоза урогетитального тракта в несколько раз шире, в сравнении с результатами рутинных клинических обследований. Следует отметить, что оно напоминает кишечную микробиоту своим качественным составом, в том числе анаэробами.
Подобно микробиоте кишечника микробное сообщество слизистых половых органов женщин гомеостатично и играет положительную роль в обменных процессах и защите от внешних патогенов. В то же время оно проявляет и враждебные по отношению к хозяину функции, если состав микробиоты нарушен и токсинообразование, характерное для большинства представителей нормальной микробиоты, становится клинически значимым и может угрожать здоровью женщины. Более того, оно может угрожать и главной физиологической функции женских половых органов – репродуктивной [6].
По данным из научной литературы, воспалительные процессы внутренних половых органов составляют 62,5 % в структуре гинекологической заболеваемости, причем, у 9,5% женщин диагностируютгнойные воспалительные заболевания маточных труби яичников.
Отмечается, что инфекционные заболевания редко вызываются одним возбудителем. Смешанные инфекции составляют примерно 20–30 % в структуре инфекционных заболеваний матки и придатков, т.е. почти у каждой третьей пациентки выявляется инфекционный процесс, вызванный несколькими возбудителями. Подавляющее большинство воспалительных заболеваний органов малого таза обусловлено собственной условно-патогенной микробиотой, ведущая роль в развитии которых принадлежит наиболее вирулентным анаэробам, энтеробактериям и коккам. Исследованы 21 инфицированный биоптат от 10 пациенток перенесших операции по разным поводам [8]. Из 54 таксонов микроорганизмов, контролируемых в процессе анализа, 32 показывают избыточный рост (инфекцию). Инфицирование каждого исследованного материала включает несколько (до двенадцати) таксонов микроорганизмов. Это подтверждает тезис о смешанном характере инфекции половых органов женщин. Полученные данные подтверждают также сформировавшееся представление о доминировании анаэробов. Их доля составляет 70–90 % по нашим измерениям и соответствует оценке других авторов.
Результаты этого анализа перспективны для выявления и консервативного лечения подобного рода заболеваний на ранних стадиях, а также уточнения механизма возникновения патологических изменений матки и придатков, приводящих к необходимости оперативного вмешательства.
При инфекционном простатите в разных исследованиях выявлены представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии рода Pseudomonas, энтерококки (Enterococcus faecalis, E.faecium и другие), Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis, Corynebacterium, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus, and Escherichia, Flavobacterium spp., Pseudomonas testosteroni. Исследование ДНК секрета и биоптатов простаты свидетельствует о наличии в них микроорганизмов, отличающихся от микробиоты кожи и прямой кишки, и, следовательно, не обнаруживаемых традиционными методами. Действительно, генетическим методом удалось определить в семени наличие 15 видов необычных анаэробов родов Peptostreptococcus, Prevotella, Corynebacterium, Rubrivirax, Actinobacillus, Veilonella и Eubacterium, а также трех аэробов: Streptococcus salivarius, S.pneumoniae и Burkholderia picketii [25, 26]. В секрете простаты обнаружено большое количество недектируемых в обычной клинической практике коринеформных бактерий, причем в сложном сообществе с Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus и Escherichia, состав которого различен у разных пациентов. Кроме того, обнаружены микробные ассоциации и у здоровых мужчин, однако иные, чем у больных и в меньшей концентрации.
Заключение
Приведенные примеры в целом показывают, что диагностика возбудителей инфекционных процессов по данным масс-спектрометрии биологических жидкостей является экспресным, чувствительным и универсальным методом индикации, одинаково эффективным как для аэробных, так и для анаэробных микроорганизмов. При этом следует отметить, что инфекции в подавляющем большинстве случаев полимикробны, в них доминируют анаэробы, в воспалениях существенную роль в провоспалительных и противовоспалительных актах играет собственная автохтонная микробиота организма человека.
Метод МСММ может быть использован для определения любого микроба, имеющего в составе структурных клеточных компонетов вещество-маркер, отличное от химических веществ фоновой биологической жидкости. Наблюдения и литературные данные свидетельствуют о достаточном количестве клеточных компонентов, специфичных сугубо для возбудителя, по которым его можно идентифицировать, используя индивидуальные или коллективные маркеры [26].
Чувствительность метода составляет 10 4 –10 5 клеток в пробе в зависимости от содержания маркера в клетке. В настоящее время для проведения анализа требуется не более 3 ч на 1 образец, или 7 часов на серию из 5 проб. Экспрессность и универсальность анализа при возможности точного определения численности микроорганизмов позволили за короткий срок пополнить сведения о микробной этиологии многих заболеваний сердечно-сосудистой системы [24], органов дыхания и пищеварительной системы, кожи [10, 11], урогенитального тракта, послеоперационных и травматических инфекций. Полученные для каждого больного данные по составу микроорганизмов, участников инфекционного процесса при оценке общего микроэкологического статуса, позволяют врачу получить качественно новую обширную информацию для принятия адекватной антимикробной и общей терапии.
Информация о практике проведения МСММ
Кровь (из пальца или из вены), мокрота, гнойный экссудат, вагинальный секрет, эякулят, мазки моча, себум, соскобы, биоптаты тканей (соединительная ткань, эпителий).
Результаты исследования микробных маркеров в крови методом газовой хроматографии масс-спектрометрии (анализ микробиоты тонкой кишки)
Применение масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике
Источники:
Г.А. Осипов, Г.Г. Родионов. Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им А.Н. Бакулева РАМН, Москва; Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург. Микроэкология человека в норме и патологии по данным масс-спектрометрии микробных маркеров. // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2013. № 2 – С.43-53
Клиенты ИАТ – частные и государственные медицинские учреждения.
Литература:
См. также:
Будьте здоровы!
ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ